Loading...
Please wait, while we are loading the content...
Similar Documents
Entwicklung einer Methode der zufälligen Domänenkombination zur Optimierung von Peptidoglykan-Hydrolasen für die Anwendung im Lebensmittel am Beispiel von Listeria spp. mit anschließender Charakterisierung ausgewählter Proteine
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Scherzinger, Anna S. |
| Copyright Year | 2012 |
| Abstract | Endolysine degradieren das Peptidoglykan, wodurch die Bakterienzelle osmotisch destabilisiert wird und birst. Diese Enzyme sind auserst spezifisch fur bestimmte Bakterienarten und -gattungen, weshalb sie ein groses Potential fur die gerichtete Eindammung von Infektionskrankheiten darstellen und auf der Suche nach Losungen fur eine naturliche und gezielte Bekampfung von pathogenen Bakterien zunehmend an Interesse gewinnen. Endolysine sind modular aufgebaut, so dass sich die Funktionen der Zellbindung und der Hydrolyse distinkten Domanen zuweisen lassen. Durch die Bildung von Chimaren konnen neue Molekule mit veranderten Eigenschaften generiert werden. Somit lassen sich beispielsweise Substratspezifitat, Lyseeffizienz, geringe Proteinstabilitat oder die Aktivitat in Gegenwart von interferierenden Substanzen verandern. Das Prinzip wird genutzt, um diese Proteine je nach gewunschten Eigenschaften fur eine Anwendung zu modifizieren. Chimarenbildung erfolgte bisher uber den aufwendigen rationalen Ansatz, einzelne Proteine zu entwerfen, zu klonieren und zu testen, wobei eine Vielzahl der Konstrukte nicht den Anforderungen entsprach. Im Zuge dieser Arbeit sollte daher ein neuer Ansatz verfolgt werden, namlich der zufalligen Kombination von Domanen aus Zellwand-Hydrolasen mit anschliesendem Screening auf gewunschte Eigenschaften, so dass gezielt geeignete Molekule identifiziert werden konnen. Dies erfolgte am Beispiel von Lysinen gegen Listeria. Listeria monocytogenes ist ein ernstzunehmender Lebensmittelpathogen, der durch seine Fahigkeit, in vakuumverpackten und gekuhlten Lebensmitteln zu wachsen, nur schwer kontrollierbar ist. Der Zusatz eines listerienspezifischen Enzyms wurde Kommensale und Nutzbakterien schonen und durch Eliminierung oder Inhibition des Krankheitserregers die Sicherheit von Lebensmitteln erhohen. Die angestrebte Strategie sah vor, verschiedene Domanen aus Zellwand-Hydrolasen zufallig miteinander zu Proteinen mit 2 und 3 Domanen zu kombinieren, wobei jede Domane fur jede mogliche Position zugelassen wird. Hierfur wurde zunachst eine Klonierungsmethode entworfen und erfolgreich umgesetzt. Diese Methode umfasst eine zeitsparende Probenvorbereitung fur die Erstellung positionsspezifischer DNA-Fragmente mit anschliesender zufalliger Ligation an der Festphase. Es wurden 2- und 3-Domanen Proteine generiert unter der Verwendung von 6 Zellbindedomanen aus Listerien-Endolysinen und 12 enzymatisch aktiven Domanen aus Endolysinen, Autolysinen, einem Bakteriozin und einem lytischen Phagenschwanzprotein mit verschiedenen Spezifitaten und Domanenmotiven. Mehr als 1057 Varianten mit 2 Domanen und 15497 Varianten mit 3 Domanen wurden analysiert. Im initialen Schritt wurde generell auf Funktionsfahigkeit gegen ein Listerien-Serovar gescreent. Die anschliesenden Testungen verfolgten das Ziel der spateren Anwendung im Lebensmittel, weshalb neben breiter Serovarspezifitiat auch auf Aktivitat bei saurem pH, Toleranz von EDTA sowie Wachstumsinhibition von Listerien getestet wurde. Funf selektierte chimare Proteine wurden gereinigt und zusammen mit den Wildtyp-Endolysinen Ply511, PlyP40 und PlyP825 auf chemische, proteolytische und Temperatur-Stabilitat, pH- und Salz-Optima, den Einfluss von EDTA auf die Enzymaktivitat sowie minimale inhibitorische Konzentration und minimale bakterizide Konzentration untersucht. Als Beispiel fur die Anwendung in einer sehr komplexen Lebensmittelmatrix wurde zudem die bakterizide Wirkung in Milch getestet. Das beste gescreente Molekul war EcoGU3, eine Chimare aus 3 Domanen, namlich zwei enzymatischen aktiven Domanen mit verschiedenen Spezifitaten und einer mittigen Zellbindedomane. EcoGU3 zeigte deutlich hohere Zellzahlreduktion in der Testung der minimalen bakteriziden Konzentration im Vergleich zu den untersuchten Wildtyp-Proteinen. In zukunftigen Arbeiten soll dieses Protein fur die Anwendung in einer komplexen Lebensmittelmatrix optimiert werden. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://epub.uni-regensburg.de/21541/1/Dissertation_Anna_Scherzinger.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
