Loading...
Please wait, while we are loading the content...
Similar Documents
Caracterització d'una proteïna de 55 KDa associada a la matriu nuclear durant la proliferació cel·lular
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Alemany, Aligué I María, Rosa |
| Copyright Year | 1991 |
| Abstract | L'estudi realitzat ha estat la identificacio i caracteritzacio de proteines de la matriu nuclear, concretament d'una proteina de 55 KD (p55) associada a la fase replicativa de l'ADN durant la proliferacio cel.lular.La matriu nuclear es una estructura obtinguda despres d'una extraccio de cromatina i components solubles de nuclis amats. Durant els ultims anys s'ha implicat a la matriu nuclear en importants funcions com son: l'organitzacio i replicacio de l'ADN, la transcripcio i l'accio hormonal (1, 2, 3, 4, 5, 6). Nombroses evidencies desvetllen la importancia dels components de la matriu nuclear en la regulacio de la sintesi de l'ADN i la proliferacio cel.lular, com l'increment d'expressio de molts oncogens, que codifiquen proteines nuclears les quals s'associen a l'activacio proliferativa de diversos tipus cel.lulars normals (7, 8, 9, 10). Tambe s'ha descrit l'increment de moltes altres proteines, incloent la calmodulina, proteines acceptores de calmodulina (11) i distins enzims replicatius com l'ADN polimerasa a, l'ADN primasa, la 3'-5'-exonucleasa, l'ARNasa H i l'ADN metilasa, les quals s'associen a la matriu nuclear dels hepatocits durant la fase replicativa de la regeneracio (12).Totes aquestes dades suggereixen que la sintesi de certes proteines i la seva associacio amb la matriu nuclear pot esser un proces important per a la regulacio de la replicacio de l'ADN i la proliferacio cel.lular en general.El treball desenvolupat s'ha centrat en la identificacio d'una proteina de 55 KDa (p55) associada a la matriu nuclear, que incrementa paral.lelament a l'inici de la sintesi d'ADN durant la regeneracio hepatica despres d'una hepatectomia parcial (13). L'hepatectomia parcial ha estat el model emprat per l'estudi dels canvis proteics associats a la matriu nuclear dependents de les distintes fases dels cicle ceLlular.El fet de que la p55 incrementes paral.lelament a la sintesi d'ADN suggeria que fos una proteina relacionada directament amb la replicacio de l'ADN.A causa de l'interes que representa l'estudi dels processos i factors que intervenen en el desenvolupament de la sintesi d'ADN i posterior divisio cel.lular, i ates que es desconeixen les proteines que forment part o intervenen en l'estructura interna de la matriu nuclear, l'objectiu d'aquest estudi ha estat la caracteritzacio de la p55. Per tal proposit s'ha purificat i s'han produit anticossos policlonals contra la p55, amb els quals s'han realitzat estudis immunocitoquimics que han desvetllat la localitzacio nuclear d'aquesta proteina en el teixit hepatic regenerant.A partir de la sequencia parcial d'aminoacids, s'ha obtingut que la p55 presenta una granhomologia amb les queratines, concretament amb la queratina num. 8.Ates que les queratines son proteines de la familia de filaments intermedis, descrits comconstituents dels citoesquelet cel.lular i per tant la seva localitzacio es citoplasmatica i no nuclear, com en el cas de la p55, es plantejaren estudis paral.lels emprant anticossos contra la p55 i contra les queratines.Els estudis realitzats a nivell bioquimic, en teixit hepatic, semblen indicar que la p55 detectada en la matriu nuclear es tracta de la queratina 8. Ja que el patro de les dues proteines es el mateix tant a nivell d'electroforesi bidimensional, com a nivell de fosforil.lacio in vitro i mitjancant immunotransferencies emprant els anticossos esmentats anteriorment.Com a conclusio d'aquests resultats es podria afirmar, tal com hem indicat, que les duesproteines son la mateixa, si no fos pels resultats obtinguts en els estudis immunocitoquimics emprant l'anticossos anti-p55 i anti-queratines, en els quals s'ha comprovat que la queratina presenta distribucio citoplasmatica i la p55 nuclear.Posteriorment, s'inicia l'estudi de la p55 en distintes linies cel.lulars en cultiu, per poder generalitzar i comprovar els resultats obtinguts en el teixit hepatic regenerant.S'ha utilitzat la linia cel.lular NRK 44F (cel.lules normals no epitelials de ronyo de rata).Aquestes cel.lules resultaven un model d'estudi interessant i comparable amb el de la regeneracio hepatica post-hepatectomia parcial, ja que presenten la capacitat d'esser activades i sincronitzades en les distintes fases del cicle cel.lular.S'ha analitzat, mitjancant tecniques immunocitoquimiques, la presencia de la p55 en aquestes cel.lules en diferents fases del cicle cel.lular i s'ha observat que, al igual que en el fetge, la p55 es detecta exclusivament en el nucli de les cel.lules NRK en fase S. L'analisi bioquimica ens indica que el patro electroforetic bidimensional de la proteina detectada en les cel.lules NRK, es similar al de la p55 de les cel.lules hepatiques. Presenta una forma majoritaria i distintes isoformes d'igual pes molecular, degudes a diferents graus de fosforil.lacio. En canvi, el pes molecular de la proteina detectada per l'anticos anti-p55 en aquestes cel.lules no es de 55 KOa, si no de 62 KOa.Pel que fa a la correlacio que hi ha entre la p55 i la citoqueratina 8 en les cel.lules hepatiques, es interessant indicar que les cel.lules NRK 44F no son cel.lules d'origen epitelial (tipus cel.lular que presenta tipicament queratines com a components dels filaments intermedis), son fibroblasts, i aquests presenten vimentina com a component dels filaments intermedis.S'ha comprovat, mitjancant estudis immunocitoquimics i per immunotransferencia la composicio dels filaments intermedis de les cel.lules NRK, emprant els anticossos antiqueratina i anti-vimentina. Ja que es conegut que alguns tipus cel.lulars que contenen un unic tipus de filament intermedi, a l'adaptar-se a les condicions de cultiu o degut a factors tumorals (en el cas de linies tumorals), expressen nous tipus de filaments intermedis que coexisteixen amb els originals.Els resultats obtinguts han estat els esperats. Les cel.lules NRK no presenten queratines, unicament presenten vimentina.Tambe s'ha caracteritzat la p55 en altres tipus cel.lulars com son: les cel.lules HeLa (cel.lules d'adenocarcinoma huma), MOCK (cel.lules epitelials de ronyo de gos), BRL (cel.lules d'hepatocarcinoma de rata) i cel.lules 3T3 NIH (fibroblasts de ratoli). En totes aquestes cel.lules, l'anticos anti-p55 presenta localitzacio exclusivament nuclear. En canvi s'han observat diferencies respecte a la proteina detectada. En les cel.lules HeLa i MDCK l'anticos anti-p55 detecta especificament una proteina de 55 KOa, igual que en les cel.lules hepatiques. Una altra caracteristica comu entre aquestes cel.lules i les del fetge es que presenten queratines i concretament la queratina 8, com component dels filaments intermedis.En les cel.lules 3T3 NIH, l'anticos anti-p55 detecta una proteina de 60-62 KOa. Aquest resultat coincideix amb l'obtingut en les cel.lules NRK. Cal destacar que ambdos tipus de cel.lules son fibroblasts i presenten vimentina com component dels filaments intermedis.Aixi doncs podem indicar que l'anticos anti-p55 detecta una proteina de localitzacio nuclear independentment del tipus cel.lular que es tracti. En canvi en les cel.lules d'origen epitelial o que contenen queratina 8, la proteina detectada per l'anticos presenta 55 KOa de pes molecular i en els fibroblasts o cel.lules que no contenen queratina la proteina detectada presenta entre 60-62 KOa.S'ha intentat esbrinar si la proteina de 62 KOa detectada en els fibroblasts presenta alguna correlacio amb la vimentina, com es el cas de la p55 i la queratina 8 en el fetge. Pero, a mes de presentar distint pes molecular, ja que la vimentina te un pes molecular de 57 KOa, presenten diferent patro electroforetic, aixi com tampoc s'ha observat que l'anticos antivimentina reconegui la p55, ni l'anticos anti-p55 la vimentina, contrariament al que s'observava amb la p55 i la queratina 8 en el fetge.CONCLUSIONS:Com a conclusio final podem dir que la proteina detectada per l'anticos anti-p55, encara que no presenti sempre una correlacio amb el tipus de filament intermedi tipic del tipus cel.lular en estudi, te relacio amb els filaments intermedis degut a la sequencia d'aminoacids que presenta. La proteina identificada es pot considerar una proteina estructural de la matriu nuclear implicada en la segregacio dels cromosomes durant la divisio cel.lular, ja que els estudis immunocitoquimics realitzats en cel.lules en mitosi, emprant l'anticos anti-p55, ens mostren una reaccio associada als cromosomes i a vegades seguint el mateix patro que el fus mitotic.BIBLIOGRAFIA:1- Nelson, W.G.; K.J. Barrack and O.S. Cotfey. 1986. Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 457475.2- Pardoll, O.M.; B. Volgestein and O.S. Coffey. 1980. Cell 19: 527-536.3- Smith, H.C. and R. Berezney. 1982. Biochemestry 21: 6751-6761.4- Smith, H.C. and R. Berezney. 1983. Biochemestry 22: 3042-3046.5- Jackson, O.A. and P.R. Cook. 1986. EMBO J. 5: 1403-1410.6- Berezney, R. and O.S. Cotfey. 1975. Science 189: 291-293.7- Kelly, K.; B.H. Cochram, Ch.O. Stiles and P.Leder. 1983. Cell 35: 603-610.8- Thompson, C.B.; P.B. Challoner, P.E. Neiman and M. Groudine. 1986. Nature 319: 374380.9- Greenberg, M.E. and E.B. Ziff. 1984. Nature 311: 433-438.10- Thompson, N.L.; J.E. Mead, lo Braun. M. Goyette, P.R. Shank and N. Fausto. 1986.Caneer. Res. 46: 3111-3117.11- Serratosa, J.; M.J. Pujol, O. Baehs and E. Carafoli. 1988. 8ioehem. 8iophys. Res.Commun. 150: 1162-1169.12- Tubo, R.A. and R. Berezney. 1987. J. 8iol. Chem. 262: 1148-1154.13- Higgins, G.M. and R.M. Anderson. 1931. Mreh. Pathol. 12: 186-202. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | http://diposit.ub.edu/dspace/bitstream/2445/36048/1/01.RMAA_1de3.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
