Loading...
Please wait, while we are loading the content...
Similar Documents
Transfert de gènes dans les hépatocytes à l'aide de vecteurs rétroviraux
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Ferry, Nicolas Danos, Olivier Heard, Jean Michel |
| Copyright Year | 1991 |
| Abstract | Le foie constitue une cible privilégiée pour un transfert de gènes à visée thérapeutique. Il est le siège de nom breux dérèglements héréditaires gra ves qui ne pourraient être corrigés que dans le contexte de la fonction hépatique (et donc dans les hépato cytes eux-mêmes) . C 'est le cas, par exemple, de certaines formes d'hyper cholestérolémie familiale secondaires à des mutations touchant le gène du récepteur des LDL. Dans le cas de déficits touchant une fonction extra hépatique, le transfert dans le foie d'un gène devant exercer son effet à distance pourrait également se révé ler efficace . Le rôle physiologique du foie, pourvoyeur de la plupart des protéines plasmatiques et organe de détoxification, le place en effet en position intéressante comme siège de l 'expression d'un gène étranger intro duit dans un but thérapeutique. Une approche envisageable consiste rait à effectuer le transfert de gène sur des hépatocytes prélevés après traitement du foie par la collagénase et mis en culture . Pour juger de la faisabilité de cette technique, nous avons défini des conditions de culture permettant une infection des hépa tocytes de rat par des vecteurs rétro viraux amphotropes véhiculant le gène de la B-galactosidase d' E. coli Nous utilisons le gène nlslac Z [ 1 ] , qui code pour une enzyme à localisation nucléaire. Ceci nous permet de réa liser des doubles colorations qui révè lent l 'activité du gène transféré par une coloration nucléaire et l 'existence de marqueurs hépatocytaires par une coloration cytoplasmique (peroxydase, glucose-6-phosphatase ) . Ainsi pouvons-nous affirmer que les cellu les exprimant le gène transféré sont bien des hépatocytes, et non des cel lules biliaires ou endothéliales qui contaminent fréquemment ces cultu res. En effectuant l ' infection trois jours après la mise en culture en l 'absence de sérum de veau, nous parvenons à infecter 10 % à 1 5 % des hépatocytes. Nous avons ensuite cherché à réimplanter ces hépatocy tes modifiés dans l 'organisme. Alors que des cellules fraîchement explan tées sont capables de former un tissu hépatique après réinjection [2] , nos tentatives pour reproduire ce phéno mène à partir de cellules maintenues quelques jours en culture ont toujours échoué. Nous nous sommes alors orientés vers une autre approche dans laquelle nous avons cherché à obtenir l ' infec tion d' hépatocytes in situ par des vec teurs rétroviraux . Ce travail a été mené en collaboration avec l 'équipe chirurgicale du Pr D. Houssin (labo ratoire de chirurgie expérimentale, CHU Cochin, Paris, France) [3] . Il est possible, chez le rat et la souris comme chez l'homme, d'exclure tem porairement le foie de la circulation et de le perfuser sélectivement in situ [4] . Nous avons utilisé cette méthode chez le rat pour infecter des hépatocytes in vivo avec notre vecteur rétroviral portant nlslac Z. La perfu sion est effectuée 24 heures après une hépatectomie de 70 % qui provoque une régénération du tissu hépatique et facilite l ' infection rétrovirale . Un volume d'environ 50 ml de surna geant viral, contenant 10 5 particules amphotropiques infectieuses par ml est perfusé avec un débit de 5 millilitre par minute. Les animaux sont sacrifiés 2 à 1 5 semaines après la perfusion, le foie est fixé in toto, et une réaction de détection de la E-galactosidase est effectuée sur des coupes à congélat ion . Avec cette méthode, nous sommes capables de transférer le gène rap porteur dans les hépatocytes, et son expression peut être mise en évi dence plusieurs mois après l 'opéra tion (le délai le plus long est actuel lement de 9 mois) . Les cellules inté ressées par le transfert de gène pré sentent un noyau bleu après révélation de l 'activité B-galactosidase (figure 1 ) . Elles apparaissent isolées ou en petites colonies de 2 à 10 cel lules, réparties uniformément dans le parenchyme hépatique . Cet aspect suggère, en accord avec les travaux anciens sur la régénération hépatique, que tous les hépatocytes participent à ce processus [5-7] . De 1 % à 5 % des hépatocytes reçoi vent et expriment le gène rappor teur, soit un total de 20 à 80 mil lions de cellules. Ce niveau d'effi cacité permet d 'envisager la distri bution à l 'organisme, à partir du foie, d 'une protéine thérapeutique exprimant un transgène; voire l 'éli mination d 'un métabolite toxique du sérum. Une des conditions requises pour l 'utilisation thérapeu tique éventuelle des techniques de transfert génétique est la possibilité de cibler un type cellulaire à l 'exclusion de tous les autres. La procédure de perfusion du foie isolé du reste de l 'organisme, associée à l 'utilisation de vecteurs rétroviraux strictement défectifs (ou incompé tents) pour la réplication, évite la propagation accidentelle du vecteur à un autre organe que le foie. Nous l 'avons vérifié en utilisant un test de PCR capable de révéler une copie du transgène dans 10 000 cel lules. Alors que le transgène nlslac Z était facilement mis en évidence par cette technique dans le tissu hépatique des animaux traités, il n'était pas détectable dans les autres tissus (poumons , rate , reins, cer veau) . Notre objectif est maintenant d 'éva luer si le transfert de gène dans les hépatocytes, effectué dans ces con ditions, s 'accompagne d 'effets secon daires indésirables à long terme, et s ' il présente un intérêt thérapeuti que . Pour cela, nous répétons ces expériences sur des séries importan tes de rats qui ne sero"nt analysés que dans plusieurs mois. Par ail- |
| Starting Page | 1088 |
| Ending Page | 1088 |
| Page Count | 1 |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| DOI | 10.4267/10608/4513 |
| Volume Number | 7 |
| Alternate Webpage(s) | http://www.ipubli.inserm.fr/bitstream/handle/10608/4513/MS_1991_10_1088.pdf?isAllowed=y&sequence=1 |
| Alternate Webpage(s) | https://doi.org/10.4267/10608%2F4513 |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
