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Charakterisierung eines Mausmodells zur BH4-sensitiven Phenylketonurie
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Eichinger, Anna |
| Copyright Year | 2019 |
| Abstract | Phenylketonurie (PKU) ist eine angeborene Storung des Aminosaurestoffwechsels, die unbehandelt zu schweren neurologischen Schaden fuhrt. In vielen Fallen ist die einzige mogliche Behandlungsoption eine streng eiweisarme Diat. Im Rahmen klinischer Studien konnte gezeigt werden, dass etwa ein Drittel der Patienten auf die Gabe pharmakologischer Dosen des naturlichen Kofaktors der Phenylalaninhydroxylase (PAH), Tetrahydrobiopterin (BH4), ansprechen (Muntau et al. 2002). Mit der Hilfe von BH4 ergab sich eine Behandlungsalternative, die den Patienten erlaubte ihre Diat zu lockern und mehr naturliches Protein mit der Nahrung aufzunehmen (Muntau et al. 2002). Zentrale Fragestellung der vorliegenden Doktorarbeit war die Identifikation und eingehende Charakterisierung BH4-sensitiver Mausmodelle. Das homozygote Mausmodell Pahenu1/enu1 tragt die Variante p.Val106Ala der murinen Phenylalaninhydroxylase (Pah). Der Aminosaureaustausch beeintrachtigt die regulatorische Domane und fuhrt zu einem milden PKU-Phanotyp. Das homozygote Mausmodell Pahenu2/enu2 ist Trager der Mutation p.Phe263Ser, die in der katalytischen Domane des Enzyms gelegen ist und zum klinischen Bild einer schweren PKU fuhrt. Pahenu1/enu2 zeigt als compound-heterozygotes Mausmodell einen intermediaren klinischen Phanotyp. Die Aminosauren Phe 263 und Val 106 sind zwischen der murinen Pah und der humanen PAH konserviert. Wie im entsprechenden Mausmodell fuhrt die Variante p.Val106Ala beim Menschen zu einem milden Phanotyp und p.Phe263Ser zu einem schweren Phanotyp. Bei Analyse der enzymkinetischen Parameter am rekombinanten Protein (Wildtyp, p.Val106Ala, p.Phe263Ser) konnte eine gute Vergleichbarkeit zwischen der murinen und humanen PAH gezeigt werden. Unterschiede in den Enzymaktivitaten zwischen Proben von murinen und humanen Leberlysaten beruhen auf unterschiedlichen hepatischen PAH-Mengen. Die im Rahmen der Arbeit erhobenen Daten zeigten, dass die murine Pah ein gut geeignetes Modell fur das PAH-System des Menschen ist. Sowohl fur Pahenu1/enu1 als auch fur Pahenu1/enu2 konnten wir nachweisen, dass diese Mausmodelle von einer pharmakologischen Therapie mit BH4 profitieren und somit eine BH4-Sensitivitat vorliegt. Pahenu2/enu2 zeigte kein Ansprechen auf die BH4-Therapie. Am rekombinant hergestellten Protein fuhrte die Variante p.Val106Ala in vitro weder zu einer Verminderung der Affinitat zum Kofaktor noch zu einer Reduktion der spezifischen Enzymaktivitat. Somit kann die Wirkung von BH4 nicht durch eine direkte Wirkung als Kofaktor der enzymatischen Reaktion erklart werden. In biophysikalischen und biochemischen Experimenten an gereinigten Proteinen und im zellularen Modell konnte gezeigt werden, dass die Variante p.Val106Ala zu vermehrter Aggregation und Degradation neigt und damit zu einer Verminderung des intakten Enzyms fuhrt. Auf molekularer Ebene induzierte BH4 eine Korrektur der p.Val106Ala-Proteinfehlfaltung und fuhrte somit, als sogenanntes pharmakologisches Chaperon, zu einer Erhohung der effektiven intrazellularen Konzentration von korrekt gefalteter und funktionaler Pah. Beim Vergleich der pharmakokinetischen und -dynamischen Parameter einer BH4-Therapie von Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 haben wir Unterschiede zwischen diesen beiden BH4-sensitiven Mausmodellen festgestellt. Dies zeigt, dass die BH4-Wirkung nicht nur von der BH4-sensitiven Variante (hier p.Val106Ala) bestimmt wird, sondern auch vom zweiten Allel beeinflusst wird. Dieser Effekt der interallelischen Komplementation sollte bei den compound-heterozygoten Patienten berucksichtigt werden und konnte erweiterte Testprotokolle notwendig machen. Im Rahmen der ex vivo Experimente wurden bei nicht diatetisch oder pharmakologisch therapierten Mausen Unterschiede in den freien, intrazellularen BH4-Konzentrationen zwischen den verschiedenen Mausgenotypen beobachtet. Interessanterweise waren diese Unterschiede der BH4- Konzentration nicht im Blut zu beobachten. Die intrazellulare BH4-Konzentration von Hepatozyten war bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 im Vergleich zum Wildtyp sowie zu Pahenu2/enu2 erniedrigt. Es konnten keine Unterschiede in der Expression des Schlusselenzyms der Tetrahydrobiopterin- Biosynthese, Gch1, nachgewiesen werden. Daruber hinaus konnte ein ungehemmter BH4-Verbrauch im Rahmen eines enzymatischen Uncoupling fur die Pahenu1-Allel tragenden Mause ausgeschlossen werden. Wir konnten in vitro zeigen, dass zwar kein Unterschied in der absoluten BH4-Konzentration vorliegt, jedoch eine Verschiebung innerhalb des BH4-Pools stattfindet, was zu einer Reduktion des freien BH4 fuhrte. Bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2, die das Allel p.V106Ala tragen, scheint es in den Hepatozyten zu einer verstarkten Bindung von BH4 an die Pah (trapping) zu kommen, so dass BH4 nicht mehr frei verfugbar in der Zelle vorliegt. Somit kommt es neben dem mutationsbedingten Funktionsverlust der p.Val106Ala-Pah auch zu einem sekundaren BH4-Mangel, der zu einer weiteren Verminderung der Enzymaktivitat beitragen konnte. Die Gabe von pharmakologischen Dosen von BH4 konnte neben der Korrektur der Proteinfehlfaltung als pharmakologisches Chaperon somit auch einen Ausgleich des sekundaren intrazellularen BH4-Mangels bewirken. Ein besseres Verstandnis der molekularen Mechanismen der Krankheitsentstehung und der pharmakologischen Korrektur bei den BH4-sensitiven Mausmodellen Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 kann dazu beitragen, die pharmakologische Therapie, zum Beispiel durch die Entwicklung von optimierten oder neuen Wirkstoffen, zu verbessern und effizienter zu machen. Daruber hinaus konnen diese Mausmodelle auch genutzt werden, um grundsatzliche Fragestellungen zu Proteinfehlfaltungserkrankungen und Degradationsmechanismen zu adressieren. So konnten die Mausmodelle bei Untersuchungen der zellularen Degradationsmaschinerie, des Einflusses von oxidativem Stress auf Proteinfaltung und der Korrektur der gestorten Proteinhomoostase mittels Proteostase-Regulatoren verwendet werden. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24000/1/Eichinger_Anna.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
