Loading...
Please wait, while we are loading the content...
Similar Documents
Untersuchungen zur biochemischen Charakterisierung der humanen Xylosyltransferase I und II
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Müller, Sandra E. M. |
| Copyright Year | 2005 |
| Abstract | Die vorliegenden Untersuchungen beschaftigten sich mit dem Enzym Xylosyltransferase I (EC 2.4.2.26, XT-I), welches die Biosynthese von Glykosaminoglykanen in Proteoglykanen durch den Transfer von Xylose auf spezifische Serin-Reste des Core-Proteins initiiert, und dem XT-II-Protein, dessen physiologische Funktion noch vollig unbekannt ist. Durch die Klonierung von unterschiedlichen XT-I-Mutanten konnte eine funktionelle Analyse der humanen XT-I beschrieben werden und es gelang im Rahmen dieser Arbeit erstmalig die rekombinante Darstellung der humanen XT-II in Insektenzellen. Der Basisvektor pCG255[Delta]1-148-XT-I diente als Grundlage fur die Etablierung von unterschiedlichen XT-I-Mutanten, welche fur die Analyse der katalytischen Aktivitat, der Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat und der Identifizierung der Heparin-Bindungsregion eingesetzt wurden. Es wurden 14 hochkonservierte Cystein-Codons durch gerichtete Mutagenese zu Alanin-Codons mutiert und zusatzlich aminoterminal verkurzte XT-I-Deletionsmutanten generiert. Nach heterologer Expression in High-Five-Insektenzellen wurde die katalytische Aktivitat der Enzyme quantifiziert, dabei konnten 5 Cystein-Reste als essentiell fur die Erhaltung einer katalytisch aktiven XT-I bestimmt werden. Die Identifizierung des minimalen Core-Proteins der XT-I erfolgte durch Expression und funktionelle Analyse von aminoterminalen Deletionsmutanten. Deletion von 272 oder mehr aminoterminalen Aminosauren fuhrte zu nahezu vollstandig inaktiven Enzymen, wahrend Mutanten mit maximal 260 deletierten Aminosauren eine zur rekombinanten XT-I vergleichbare Aktivitat zeigten. Durch Western-Blot-Analyse konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die rekombinante XT-I in aktiver Form als Monomer vorliegt und keine Dimerisierung erfolgt. Auserdem konnte gezeigt werden, dass die rekombinante XT-I keine freien Cystein-Reste besitzt. Fur die Heparin-Bindungsregion der XT-I konnte eine dreidimensionale Struktur ausgeschlossen und ein potentielles Sequenzmotiv in Position Pro721 bis Ile727 beschrieben werden. Die humane XT-II wurde innerhalb dieser Arbeit erstmalig rekombinant in E. coli und in High-Five-Zellen exprimiert und ein stabiler Insektenzellklon konnte etabliert werden. Die Bestatigung der Spezifitat der XT-II-Klone erfolgte durch den immunochemischen Nachweis der Xylosyltransferasen im Zellkulturuberstand mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum gegen ein XT-I-homologes Peptid und einem monoklonalen Anti-V5-Antikorper. Die XT-I- und XT-II-Genexpression der Insektenzellklone konnte durch eine Real-Time PCR-Methode quantifiziert werden. Durch die rekombinante Expression konnte die Grundlage fur die Aufklarung der Funktion der XT-II geschaffen werden. Fur phylogenetische Untersuchungen der Xylosyltransferasen wurde das XT-Enzym einer evolutionar alten Spezies analysiert. Die XT aus dem Blauhai ist ebenso wie die humane XT-I in vitro dazu in der Lage, Xylose auf Seidenfibroin zu transferieren. Im Unterschied zum humanen Enzym erwies sich der Akzeptor Bikunin fur die Hai-XT als nicht geeignet, ein weiterer Unterschied zeigte sich bei der Analyse der Inhibition durch Heparin. Hai-XT zeigte auch bei Zusatz von 1000 IU/ml Heparin noch eine Restaktivitat von 83 v.H., wahrend bei der humanen XT-I schon 1 IU/ml Heparin fur eine vollstandige Inhibition ausreichen. Die Inhibition durch UDP erfolgte vergleichbar dem humanen Enzym und lasst daraus schliesen, dass die Bindungsregion fur den Nukleotid-Zucker evolutionar hochkonserviert ist. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://pub.uni-bielefeld.de/download/2306453/2306456/Dissertation.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
