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Entwicklung eines Massenspektrometrie-basierten Verfahrens zur Quantifizierung von HIV-Strukturproteinen und deren Stöchiometrie für neue analytische Anwendungen
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Luckau, Luise |
| Copyright Year | 2019 |
| Abstract | In der Virusdiagnostik und -forschung ist die Verfugbarkeit von genau charakterisierten viralen Referenzmaterialien von Bedeutung, da sie vor allem die Messgenauigkeit verbessern. Ein Ziel ist die genaue Quantifizierung der fur den Aufbau von Viren relevanter Biomolekule, der viralen Nukleinsaure, der funktionalen viralen Proteine, sowie deren Verhaltnisse. Die derzeit metrologisch genauesten Methoden im Bereich der Nukleinsaure-Quantifizierung ist die digitale PCR (z. B. droplet digital PCR: ddPCR) und in der Protein-Quantifizierung die Isotopenverdunnungs-Massenspektrometrie (IDMS). Beide Verfahren wurden fur die HIV-Quantifizierung auf ein in vitro hergestelltes Virusmaterial angewendet. Bei dem direkten Vergleich beider Methoden bezuglich der Wiederholbarkeit von Messungen erreichte die ddPCR eine technische Prazision von ± 0,7 % und die IDMS von ± 2,5 %. Dagegen konnte mit der IDMS aufgrund der internen Standardisierung mit ± 2 % eine bessere Reproduzier¬barkeit der Komplettanalysen im Vergleich zur ddPCR mit ± 3,8 % erzielt werden. Auf der Basis von ersten Peptide-Mapping-Analysen des HIV-Materials wurde das IDMS-Verfahren bezuglich der Quantifizierung des Gag-Polyproteins (GAGp55) etabliert, das als Vorlauferprotein alle viralen Strukturproteine Matrix (MAp17)-, Capsid (CAp24)- und p6-Protein enthalt. Das gefundene Mengenverhaltnis von MAp17, CAp24 und p6 weicht vom erwarteten aquimolaren Verhaltnis ab, was auf alterna¬tive Translations¬mechanismen ruckzufuhren ist. Aufgrund eines IRES (internal ribosomal entry site) -abhangigen Translationsmechanismus konnen MAp17-trunkierte Gag-Proteinvarianten entste¬hen, weshalb die MAp17-Menge im Vergleich zu CAp24 um ~20 % reduziert ist. Die Ursache fur um ~30 % reduziertes p6 im Vergleich zu CAp24 ist womoglich ein RNA-Sequenzmotiv, das bekannterweise die ribosomale Leserahmenverschiebung fur die Gag-Pol-Synthese ver¬ursacht. Da die Quantifizierung von Viren als komplexe Strukturen eine Herausforderung darstellt, auch bezuglich der Verwendung des Quantifizierungsstandards, wurde ein Lysin- und Arginin-isotopenmarkiertes HIV-Material mittels SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) hergestellt, das chemisch genauso aufgebaut ist wie das naturliche HIV-Material. Dieses Material kann nach umfassender Charakterisierung in Zukunft fur die relative und absolute Quantifizierung eingesetzt werden. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| DOI | 10.24355/dbbs.084-201907121136-0 |
| Alternate Webpage(s) | https://publikationsserver.tu-braunschweig.de/servlets/MCRFileNodeServlet/dbbs_derivate_00045494/Diss_Luckau_Luise.pdf |
| Alternate Webpage(s) | https://doi.org/10.24355/dbbs.084-201907121136-0 |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
