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Humane Coronaviren: Entwicklung und Anwendung eines Immunoassays und Untersuchungen zur zellvermittelten Immunität
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Lehmann, Christian |
| Copyright Year | 2009 |
| Abstract | In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, ein serologisches Nachweisverfahren zu etablieren, welches in der Lage ist Serumantikorper (IgG, IgM, IgA) gegen alle 5 bekannten humanen Coronaviren (HCoV-229E, -NL63, -OC43, -HKU1 und SARS-CoV) parallel in einem einzigen Ansatz zu detektieren. Es werden nur minimale Mengen an Serum benotigt (15 µl). Ideale Antigene sind HCoV Nukleokapsid Proteine. Diese sind in der Lage, eine auserst robuste humorale Immunantwort zu induzieren und ergeben eine ausgezeichnete Sensitivitat. Die Spezifitat konnte durch Erhohung der ionischen Starke im Serumverdunnungspuffer gekoppelt mit einer Ureaelution entscheidend optimiert werden. Hierdurch wurden gelegentlich auftretende Kreuzreaktionen innerhalb der Gruppe-II-Viren (OC43 und HKU1) unterdruckt. Die einfache und unkomplizierte Handhabung verbunden mit einer hohen Spezifitat und Sensitivitat, sowie die geringen Herstellungskosten, machen das neu entwickelte System zur idealen Methode bei der vertieften Diagnostik und zu einem geeigneten System fur grosere epidemiologische Analysen. Die Leistungsfahigkeit des Line-Immunoassays wurde auch durch Untersuchungen zur HCoV-Seropravalenz bestatigt. Es wurde erstmalig gezeigt, dass die erst kurzlich entdeckten HCoVs NL63 (Erstbeschreibung 2004) und HKU1 (2005) signifikant zum allgemeinen Spektrum der HCoV-Infektionen beitragen (Seropravalenz in gesunder erwachsener Bevolkerung NL63: 62,8-94,6%; HKU1: 11,9-71,7%) und wie die anderen HCoVs, mit Ausnahme von SARS-CoV, weltweit verbreitet sind. Tatsachlich weist NL63 in allen untersuchten Populationen die hochste Seropravalenz auf und kann als bedeutender Erreger respiratorischer Erkrankungen betrachtet werden. Immunsuppression wirkt sich negativ auf den Aufbau einer robusten IgG Antikorperantwort gegen die verschiedenen HCoV aus. Dies konnte durch Vergleiche HIV-infizierter Personen mit gesunden Kontrollgruppen aufzeigt werden. Ferner wurde in der vorliegenden Arbeit der postulierte Zusammenhang zwischen einer NL63-Infektion und der Kawasaki Disease, einer systemischen Vasculitis bei Kindern, erstmalig auf serologischer Basis untersucht. Da kein Hinweis auf erhohte Pravalenz oder akute Infektion mit diesem Virus bei an Kawasaki Syndrom leidenden Kindern festgestellt werden konnte, ist eine Assoziation unwahrscheinlich. Durch Testungen von Blutproben chinesischer und kanadischer SARS-Patienten konnte die Entwicklung einer robusten humoralen Immunantwort (IgG, IgM, IgA) nach einer SARS-CoV-Infektion nachgewiesen werden. Zudem wurden in einer europaischen und in 20 chinesischen Proben von Spendern, bei denen niemals eine SARS Erkrankung diagnostiziert wurde, IgG-Antikorper gegen SARS-CoV detektiert. Es ist daher davon auszugehen, dass in der Bevolkerung gelegentlich Kontakt zu SARS oder SARS-ahnlichen Viren besteht, welcher zu Serokonversion und asymptomatisch verlaufenden Infektionen fuhrt. Bei insgesamt 13 SARS-Patienten mit mildem oder schwerem klinischem Verlauf wurden wahrend der akuten und der rekonvaleszenten Phase die Antikorperprofile aller 5 humanen Coronaviren untersucht. Patienten mit milder Erkrankung weisen eine niedrigere Seropravalenz bezuglich 229E und HKU1 auf als schwerer Erkrankte. Ein durch SARS-CoV ausgeloster Recall-Effekt, der die Basalspiegel von in der akuten Phase vorhandenen 229E und NL63 (und in geringerem Ausmase auch OC43) Antikorpern stark ansteigen lasst, ist in allen Patienten mit ungunstigem Verlauf zu beobachten. Die Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass es sich hierbei um einen infektionsverstarkenden Mechanismus von nicht-neutralisierenden, kreuzreaktiven anti-229E IgG handeln konnte. Dieser Effekt wurde auch bei anderen viralen Infektionen als antibody-dependent enhancement (ADE) beschrieben. Der Befund ermoglicht erstmals eine diagnostische Pradisposition fur einen schwereren klinischen Verlauf und die fruhzeitige Einleitung von Gegenmasnahmen. Mit Versuchen zur zellvermittelten Immunitat wurde gezeigt, dass HCoV Nukleokapsid Proteine geeignete Antigene fur die T-Zell-Diagnostik darstellen. Die meisten Spender besitzen restimulierbare, fur 229E, NL63 und OC43 spezifische T-Zellen. Dagegen konnten bei Stimulation mit dem HKU1 Antigen nur in zwei von zwolf Spendern T-Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bestatigen weitgehend die in dieser Arbeit durchgefuhrten serologischen Untersuchungen. Durch Stimulation mit HLA-Klasse-I restringierten Peptiden und durch Depletionsexperimente konnte mit Hilfe des ELISPOT-Assays festgestellt werden, dass bei der Erkennung von Epitopen auf dem NL63 Nukleokapsid ausschlieslich CD4+ T-Helferzellen beteiligt sind. Spezifische CD8+ zytotoxische T-Zellen konnten nicht detektiert werden. Durch Screening einer 15-AS-Peptidbibliothek, welche von dem NL63 Nukleokapsid abgeleitet wurde, konnten insgesamt 9 verschiedene immunoreaktive Peptide identifiziert werden. Das N Protein ist ein wichtiges Antigen in der zellvermittelten Immunitat. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://epub.uni-regensburg.de/12135/1/Dissertation_Lehmann.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
