Biochemische Charakterisierung der Isoprensynthase aus der Graupappel (Populus x canescens (Ait.) Sm.) und ihre Expression in Arabidopsis thaliana L.

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Bachl, Anette
Copyright Year	2005
Abstract	1. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die native ISPS aus der Graupappel (Populus x canescens (Ait.) Sm.) und verschiedene heterolog in Escherichia coli exprimierte Derivate, mit C-terminalem bzw. N-terminalem His-Tag sowie unmarkiert, biochemisch charakterisiert. Die ISPS zeigte ein Temperaturoptimum von 40°C, ein breites pH-Optimum von pH 7 - 8,5 und einen apparenten Km-Wert im millimolaren Bereich. Zudem konnte festgestellt werden, dass die Enzymkinetik einen sigmoiden Verlauf aufwies, der auf eine positive Kooperativitat des Enzyms hinweist. Die N-terminale Markierung der ISPS hat eine Verschiebung des pH-Optimums weiter in den alkalischen Bereich zur Folge, wahrend die C-terminal markierte ISPS im Vergleich zum N-terminal markierten Enzym eine geringere Aktivitat besas. Durch die vergleichsweise hohe Affinitat zum Substrat fiel jedoch der Unterschied bei geringen Substratkonzentrationen weniger stark aus. Das Temperaturoptimum ist bei C-terminaler Markierung um ca. 5-10°C erhoht, die Aktivierungsenergie um 50 %. Alle ubrigen Eigenschaften blieben weitgehend konstant. 2. Zur Transformation von Pflanzen wurden zwei ispS-Genderivate hergestellt. Dazu wurde das ispS-Gen aus einer cDNA-Bank der Graupappel mit zwei unterschiedlichen Epitopen markiert, um das resultierende Protein besser nachweisen und aufreinigen zu konnen. Es wurde jeweils am C-terminalen Ende der ISPS ein Epitop angehangt, das HA-Epitop, ein Nonapeptid (YPYDVPDYA) und ein His-Tag, bestehend aus sechs aneinander gereihten Histidinen. 3. Die Funktionsfahigkeit der beiden ISPS-Derivate wurde durch heterologe Expression in E. coli uberpruft. Dabei stellte sich heraus, dass das HA-Epitop zu einem volligen Verlust der Enzymaktivitat der ISPS fuhrte. Das Derivat mit His-Tag zeigte dagegen etwa 20 % der Aktivitat der unverandert in Bakterien exprimierten ISPS. 4. Mit dem funktionsfahigen ISPS-Derivat mit His-Tag wurde Arabidopsis thaliana L. transformiert. Als Transformationsvektor wurde der binare Vektor pBinAR verwendet, der einen 35S-Promotor und eine Kanamycin-Resistenz enthalt. Die Ubertragung auf die Pflanze erfolgte uber Agrobacterium tumefaciens. 5. Es konnten 40 positive Linien uber die Kanamycin-Resistenz selektiert werden, vier davon stammten aus einer ersten Transformation und konnten bereits geselbstet werden, die 36 aus einer spateren Transformation stammenden Linien lagen heterozygot vor. 6. Die stabile Insertion des ispS-Gens in das Genom von A. thaliana konnte fur alle 40 Linien uber PCR verifiziert werden. Die Genexpression konnte in 38 der 40 A. thaliana-Linien auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Eine erhohte Isoprenemission konnte fur funf der 40 Linien gemessen werden, fur die auch die Hohe der Genexpression uber quantitative RT-PCR ermittelt wurde. Zwei der funf Linien zeigten gleichzeitig zur erhohten Isoprenemission eine erhohte Genexpression. Als Grund fur die geringe Erhohung der Isoprenemission wird ein Substratmangel fur die ISPS in A. thaliana vermutet, zu dem eine geringere Aktivitat des Enzyms durch die C-terminale Markierung hinzukommt.
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Page Count	122
File Format	PDF HTM / HTML
Volume Number	7106
Alternate Webpage(s)	http://kups.ub.uni-koeln.de/1450/1/FZKA7106.pdf
Alternate Webpage(s)	https://publikationen.bibliothek.kit.edu/200060139/3814640
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article