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Caracterización molecular y celular de la biosíntesis y composición de la zona pelúcida de ovocitos de hámster (Mesocricetus auratus). Análisis filogenético de la glicoproteína ZP4 en la subfamilia Murinae
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Rico, I. José, María |
| Copyright Year | 2009 |
| Abstract | Los ovocitos de mamiferos estan rodeados de una matriz extracelular llamada zona pelucida (ZP) que esta involucrada en diferentes procesos durante la fecundacion y desarrollo embrionario temprano. Esta matriz esta involucrada en el reconocimiento y union al espermatozoide, en la reaccion acrosomica, bloqueo de la polispermia y en la proteccion del embrion preimplantado (Yanagimachi, 1994; Epifanio et al., 1994; Benoff, 1997; Wassarman, 1998; Denker, 2000; Herrler y Beier, 2000; Sinowatz et al., 2001; Dean, 2004; Hoodbhoy y Dean, 2004; Wassarman y Litscher, 2008). A pesar de la importancia del papel jugado por la ZP todavia quedan diferentes aspectos sin aclarar sobre su composicion, estructura, origen y filogenia. En la presente Tesis Doctoral se abordan algunos de los aspectos anteriormente mencionados como la composicion y origen de la ZP de ovocitos de hamster. Ademas, se inicia un estudio desde el punto de vista evolutivo de la proteina ZP4 en roedores y concretamente en la subfamilia Murinae. A continuacion se describen brevemente los experimentos realizados y resultados obtenidos: I. Analisis de la composicion de la zona pelucida de hamster. La composicion de la ZP ha sido descrita en diferentes especies y esta constituida por 3 a 6 glicoproteinas dependiendo de la especie analizada (Bleil y Wassarman, 1980; Hedrick y Wardrip, 1987; Lefievre et al., 2004; Hoodbhoy et al., 2005; Ganguly et al., 2008; Goudet et al., 2008). En mamiferos, se ha considerado que la ZP esta compuesta por tres glicoproteinas: ZP1, ZP2 y ZP3 tomando como modelo la ZP murina (Bleil y Wassarman, 1980). Sin embargo, la descripcion del genoma completo en algunas especies como el hombre o la rata ha dado lugar a la deteccion de nuevas proteinas en la ZP. Estudios recientes revelan que algunos mamiferos presentan una ZP formada por cuatro glicoproteinas como en el hombre (Lefievre et al., 2004) o la rata (Hoodbhoy et al., 2005). Estas cuatro glicoproteinas se designan como ZP1, ZP2 (ZPA), ZP3 (ZPC) y ZP4 (ZPB). La presencia de una cuarta glicoproteina en la composicion de la ZP nos hace replantearnos los diversos modelos de composicion y estructura de la ZP propuestos hasta la fecha. En el hamster, especie objeto de nuestro estudio, la caracterizacion de la ZP mediante SDS-PAGE sugeria la presencia de tres glicoproteinas diferentes: ZP1, ZP2 y ZP3 (Moller y Wassarman, 1990). Sin embargo, solamente ZP2 y ZP3 habian sido clonados (numeros de acceso en el GenBank: AY876920 (ZP2) y M63629 (ZP3)). En este estudio, mediante tecnicas de biologia molecular y proteomica se analiza la composicion de la ZP de hamster detectandose la presencia de cuatro glicoproteinas: ZP1, ZP2, ZP3, y ZP4. El ARNm de ZP1 y ZP4 es amplificado y secuenciado demostrandose su presencia en el ovario de hamster. Por otro lado, mediante tecnicas de espectrometria de masas probamos la traduccion del ADNc codificante de ZP1 y ZP4 ya que se detectan diferentes peptidos pertenecientes a estas dos proteinas. Ademas se detectan peptidos de ZP2 y ZP3, las otras glicoproteinas cuyas secuencias de nucleotidos y aminoacidos se encuentran en la base de datos (GenBank). Ademas, realizamos un analisis comparativo de la secuencia del ADNc y proteica de ZP1 y ZP4 con respecto a las glicoproteinas de la ZP de otras especies. Este analisis muestra la existencia de una alta homologia de estas glicoproteinas con las glicoproteinas de la ZP de otras especies revelando ademas la presencia de motivos comunes como el peptido senal, dominio trefoil, dominio ZP, dominio transmembrana y sitio consenso para el corte de furina. II. Estudio del origen celular de las glicoproteinas de la zona pelucida de hamster El origen celular de las proteinas de la ZP de las especies mamiferas ha sido motivo de controversia durante largo tiempo. Dependiendo de la especie, las proteinas de la ZP son sintetizadas por: a) el ovocito, b) las celulas foliculares o c) ambos (ovocito y celulas foliculares) (Kolle et al., 1996, 1998; Sinowatz et al., 2001; Bogner et al., 2004). La sintesis de la ZP solo a nivel del ovocito ha sido demostrada en raton y rata (Bleil y Wassarman, 1980b; Skinner y Dunbar, 1992; Epifano et al., 1995; Scobie et al., 1999; Sinowatz et al., 2001; El Mestrah et al., 2002) mientras que en otros mamiferos (hombre, cerdo, conejo, perro y vaca) la expresion de las proteinas de la ZP ha sido detectada tambien a nivel de las celulas de la granulosa. En este estudio, mediante tecnicas de hibridacion in situ analizamos el patron de expresion de las proteinas de la ZP en el ovario de hamster. Los resultados obtenidos revelan que la sintesis de las cuatro glicoproteinas (ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4) de hamster tiene lugar de forma exclusiva en el ovocito. No hay expresion proteica en las celulas foliculares. En cuanto a los niveles de expresion de las cuatro glicoproteinas, los ovocitos de los foliculos primordiales y los primarios de menor tamano son los que muestran una mayor expresion disminuyendo conforme el foliculo aumenta de tamano. La expresion fue muy debil o nula en los ovocitos pertenecientes a los foliculos preovulatorios o de Graaf. III. Estudio de la expresion y via de secrecion de ZP4 de hamster en celulas HEK 293T Para el estudio de la expresion y via de secrecion de ZP4 de hamster se procedio a la clonacion de la misma y transfeccion posterior en celulas HEK 293T. Nuestros resultados nos indican que la proteina es expresada en este sistema celular con alta eficacia siendo imposible su deteccion en el medio de cultivo como proteina secretada. Mediante ensayos de citometria de flujo y microscopia confocal, ZP4 de hamster se muestra anclada a nivel de la membrana celular de manera que podemos afirmar que el trafico desde el reticulo hasta la superficie celular es adecuado y concuerda con el comportamiento seguido por otras proteinas de la ZP descritas previamente (Litscher et al., 1999; Kiefer y Saling, 2002). No obstante, el hecho por el cual no es secretada permanece sin ser esclarecido pero parece estar en concordancia con algunos resultados obtenidos en estudios previos realizados con proteinas recombinantes de la familia ZPB (ZP1 y ZP4) (Tsubamoto et al., 1999; Martic et al., 2004) El analisis por SDS-PAGE y Western-blot revela un peso molecular de la proteina recombinante obtenida de la lisis celular de aproximadamente 75 kDa. Teniendo en cuenta que el peso esperado de la proteina nativa madura es de 59,946 kDa, el peso de la proteina recombinante obtenida coincide con el peso esperado que tendria la proteina sin el peptido senal y con el dominio transmembrana mas la glicosilacion (ZP4 presenta 6 sitios potenciales de N- glicosilacion), asumiendo un procesamiento similar al de otras glicoproteinas de la ZP (Litscher et al., 1999; Kiefer y Saling, 2002). IV. Analisis filogenetico de ZP4 en la subfamilia Murinae En esta Tesis Doctoral mostramos los resultados obtenidos a partir de un analisis filogenetico de ZP4 realizado dentro de la subfamilia Murinae. Esta proteina ha sido poco estudiada desde el punto de vista evolutivo siendo interesante resaltar la necesidad de un analisis de la misma debido a su importancia funcional en especies como el bovino, el porcino o el hombre. Ademas dentro de esta subfamilia encontramos una especie, Mus musculus en la que esta proteina no es expresada. El gen ha sufrido a lo largo de la evolucion una serie de deleciones e inserciones que impiden la lectura completa del ARNm codificante para dicha proteina (pseudogen). Debido a que ZP4 si se expresa en otro taxon dentro de la subfamilia, en Rattus norvegicus, podemos afirmar que ZP4, como proteina funcional, se ha perdido en algun punto del arbol evolutivo desde la divergencia de Mus y Rattus a partir de un ancestro comun. En nuestro estudio amplificamos y analizamos diferentes regiones de interes dentro de ZP4 tomando como molde el ADN genomico de 25 taxones pertenecientes a la subfamilia Murinae. El analisis revelo que la pseudogenizacion de ZP4 podria afectar solamente al subgenero Mus. Para la confirmacion de la existencia de una secuencia codificante completa para ZP4 en determinadas especies se procedio a la amplificacion de esta secuencia a partir de ADNc obtenido a partir de ARN de ovario. Hasta la fecha, las secuencias obtenidas no revelan la presencia de codones de stop de manera que la pseudogenizacion de ZP4 puede datarse hace unos 4 millones de anos. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://digitum.um.es/xmlui/bitstream/10201/9709/1/IzquierdoRico.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
