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Untersuchungen zur Interaktion und subzellulären Lokalisierung der neuronalen Proteine Synaptopodin und AIDA-1
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Caumanns, Jana |
| Copyright Year | 2013 |
| Abstract | Das Protein Synaptopodin ist in Podocyten der Niere sowie in Neuronen des Neocortex, Hippocampus, Striatum und Bulbus olfactorius zu finden. In Nervenzellen ist es nahezu ausschlieslich in dendritischen Dornen und im Initialsegment der Axone lokalisiert, und es ist masgeblich an der Ausbildung des Spine-Apparates, einer spezialisierten Form des glatten endoplasmatischen Retikulums, beteiligt. Seine Funktion in Nervenzellen ist jedoch bis heute unzureichend verstanden. Die Kenntnis der Integration von Synaptopodin in ein Netzwerk von Proteinen bietet die Moglichkeit, uber seine Funktion zu spekulieren und mit Hilfe geeigneter experimenteller Ansatze zu charakterisieren. Ausgangspunkt fur die vorliegende Arbeit war die mit Hilfe der YTH-Technik gefundene Interaktion von Synaptopodin mit einer bisher nicht beschriebenen Spleisvariante des Proteins AIDA-1, die die Arbeitsgruppe als AIDA-1-39.1 bezeichnete (B. Meyer-Hiemer, Institut fur Neuroanatomie, Universitatsklinikum Hamburg-Eppendorf, AG Mohr, Dissertation in Vorbereitung). AIDA-1, von dem zahlreiche Speisvarianten beschrieben sind, wird in Neuronen exprimiert und ist unter anderem moglicherweise an der Signalweiterleitung von der Synapse in den Zellkern beteiligt. In dieser Arbeit konnte die Interaktion von Synaptopodin mit AIDA-1-39.1 in Hefezellen bestatigt werden. Daruber hinaus wurden innerhalb des Synaptopodin-Molekuls die mit AIDA-1-39.1 interagieren Bereiche durch umfangreiche Experimente unter Verwendung des YTH-Systems naher eingegrenzt. Anschliesende immuncytochemische Analysen mit HEK-293- und COS-7 Zellen zeigten, zumindest in einigen Fallen, eine Kolokalisation der beiden Proteine im Cytoplasma. Auch in primar kultivierten hippocampalen Neuronen der Ratte wiesen einige der dendritischen Dornen sowohl AIDA-1-39.1- als auch Synaptopodin-Immunreaktivitat auf. Durch Western Blot-Analysen konnte zudem gezeigt werden, dass beide Proteine Bestandteil biochemisch gereinigter Praparationen der PSD waren. Zur weiteren Analyse der Interaktion wurden Ko-Immunprazipitationen mit Proteinlysaten von HEK-293 Zellen nach Transfektion mit Synaptopodin- und AIDA-1-39.1 Expressionsvektoren durchgefuhrt. In Western Blot-Analysen konnte die Interaktion beider Proteine nicht nachgewiesen werden. Dies lasst darauf schliesen, dass die Interaktion entweder sehr schwacher oder transienter Natur ist. Es ist ebenfalls nicht auszuschliesen, dass die in Hefezellen bestatigte Assoziation beider Proteine in Saugerzellen nicht stattfindet. Die Frage, ob Synaptopodin gemeinsam mit AIDA-1 an Signalvorgangen von der Synapse zum Zellkern beteiligt ist, bleibt daher offen. Da uber die subzellulare Verteilung der neuen Isoform AIDA-1-39.1 in Nervenzellen keinerlei Daten vorlagen, wurde dies anschliesend mit Hilfe immuncytochemischer Verfahren naher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass AIDA-1-39.1 sowohl im Zellkern sowie punktuell in Dendriten und dendritischen Dornen hippocampaler Neurone lokalisiert ist. Als masgeblich fur die Lokalisierung des Proteins in dendritischen Dornen erwies sich ein PDZ-Bindungsmotiv am C-terminalen Ende des Proteins. Abschliesend wurde in kultivierten hippocampalen Neuronen untersucht, welche Bereiche der kurzen Variante von Synaptopodin, die vorwiegend im Zentralnervensystem exprimiert wird, fur den Transport in dendritische Dornen (oder die Verankerung am Ort der Funktion) verantwortlich sind. Dazu wurden Vektoren, die fur Teilsequenzen des Proteins kodieren, zur Expression gebracht. Auf diese Weise wurden zwei Abschnitte im C-terminalen Bereich von Synaptopodin identifiziert, die unabhangig voneinander den Transport der rekombinanten Proteine in dendritische Dornen vermitteln. Synaptopodin is a protein which is located in renal podocytes and neurons of the Neocortex, Hippocampus, Striatum und Bulbus olfactorius. Here, it is almost exclusively located in dendritic spines and in the initial axon segment and it is closely linked to the spine apparatus. AIDA-1 as well is a protein expressed in neurons which might be involved in the communication between synapse and nucleus. Both proteins are very likely to play a role for synaptic plasticity, yet their exact functions are still mostly unknown. The starting point of this work was the identification of a novel AIDA-1-Isoform, AIDA-1-39.1( Bjorn Meyer-Hiemer, Department of Neuroanatomy, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, unpublished data). The protein was identified as an interaction partner of synaptopodin short in a yeast-two-hybrid-screen performed by Bjorn Meyer-Hiemer. For there is no data concerning the subcellular localisation of AIDA-1-39.1, immunochemistry was performed with transfected hippocampal neurons of he rat. It was shown that AIDA-1.39.1 is located in the nucleus as well as punctual in dendritic spines. It was also shown that The C-terminal PDZ-binding-motive seems to be essential for the location in dendritic spines. In order to characterize the targeting sequences in synaptopodin short which mediate the protein’s transport to the dendritic spine, vectors coding for subsequences of the protein were expressed in hippocampal neurons. It was shown that there are two sequences in the C-terminal region oft he protein, which mediate the dendritic location oft he protein. In addition to that, co-localisation of he proteins in the cytoplasma of the transfected eucaryotic cell lines HEK-293 and COS-7 was shown by performing immunochemistry. In hippocampal neurons co-localisation was shown in dendritic spines. Furthermore, western blot analyses were performed to show that both proteins are part of biochemically purified preparations of he post synaptic density. To further analyse the shown interaction between synaptopodin and AIDA-1-39.1, the yeast-two-hybrid-system was used. Two sequences in the synaptopodin-protein which interact with AIDA-1-39.1 independently where characterized. In order to verify the interaction of synaptopodin and AIDA-1.39.1 detected in the YTH-system, the proteins werde expressed in HEK-cells and co-immunoprecipitation was performed. In these experiments, no interaction between the two proteins could be detected. The reason for these negativ results could be a transient or weak interaction of synaptopodin and AIDA-1-39.1. Otherwise , it is also possible that the results in the YTH-system are false-positive and there is no interaction between synaptopodin and AIDA-1-39.1 in vivo. So the question if the interaction of snaptopodin and AIDA-1-39.1 does exist and might play a role for synaptic plasticity, still remains. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6515/pdf/Dissertation.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
