Análise Do Estresse Oxidativo E Da Qualidade Óssea Do Colo Do Fêmur De Ratas Submetidas Ao Treinamento De Força No Período De Periestropausa

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Author	Pinheiro, Ludimila De Araújo Ueno, Melise Jacon Peres
Copyright Year	2018
Abstract	Female aging may be associated with the increased oxidative stress and development of osteoporosis. Objective: Analyze the performance of strength training (ST) on bone quality and oxidative stress markers in senile rats. Material and Method: 20 Wistar rats (18 months) were distributed in groups: (C) control and (ST) strength training (120 days, 3 x/week). Analyses were undertaken of oxidative stress markers and bone microtomography. Results: The ST group showed the highest activity of the FRAP (ferric reducing-antioxidant power), total cortical bone area (Tt.Ar) and polar moments of inertia (polar MMI) compared to group C (p < 0.05). Conclusion: We found that strength training improved the microarchitecture and cortical bone on the femoral neck strength, increasing the total antioxidant capacity. Key-words: bone metabolism, periestropause, primary osteoporosis, oxidative stress, strength training 1 Graduanda de Fisioterapia do Centro Universitário Toledo * PIBIC – Processo FAPESP No 2018/09015-4/UNESP 2 Fisioterapeuta (UEL), Mestre em Ciências Fisiológicas (UNESP), Doutoranda em Ciências Fisiológicas (UNESP) e Professora do curso de Fisioterapia do Centro Unitoledo de Araçatuba 3 Doutoranda em Ciências Fisiológicas da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) 4 Docente da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (FOA/UNESP) 1. INTRODUÇÃO A porcentagem mundial da população com idade acima de 60 anos está crescendo em ritmo acelerado. Segundo as Nações Unidas (2015), o processo de envelhecimento populacional pode ser explicado pelo aumento na expectativa de vida. Uma das causas do envelhecimento é o dano provocado pelo estresse oxidativo, desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e antioxidantes do organismo (NEWSHOLME et al, 2012), que pode resultar em doenças crônico-degenerativas (MADEIRAS et al., 2015), como na osteoporose, problema de saúde pública mundial. A osteoporose é doença esquelética sistêmica caracterizada por baixa densidade óssea e deterioração da microarquitetura do tecido ósseo, que leva ao aumento do risco de fraturas por fragilidade, sendo detectada na maioria das vezes após evento de fratura por estresse. A incidência anual de fraturas osteoporóticas ultrapassa 1,5 milhões nos Estados Unidos e deverá aumentar para 6,3 milhões até o ano 2050, e dentre os tipos de fraturas, as de quadril são consideradas mais devastadoras do que qualquer outra (LANE, 2006; SILVA et al., 2015; GOLOB & LAYA, 2015). Múltiplos hormônios influenciam a atividade de osteoblastos e osteoclastos, incluindo o estrógeno, que exerce atuação importante na remodelação óssea (JI &YU, 2015). A alteração hormonal que ocorre no envelhecimento feminino (menopausa) resulta em aumento na atividade dos osteoclastos (reabsorção óssea) enquanto a atividade osteoblástica (formação óssea) diminui (GOLOB & LAYA, 2015; JI & YU, 2015). Portanto, mulheres pósmenopáusicas são mais predispostas à osteoporose (GOLOB & LAYA, 2015; LANE, 2006). Durante o envelhecimento, há redução da defesa antioxidante e aumento de espécies reativas de oxigênio (ERO) elevando o estresse oxidativo (ZHANG et al. 2011). O estresse oxidativo é definido como processo dinâmico ocasionado por alteração do estado redox, há desequilíbrio entre formação de espécies ERO e defesas antioxidantes, onde a formação de ERO excede às defesas antioxidantes (SÁNCHEZ-RODRÍGUEZ et al.2007), e a persistência desse estado oxidativo pode levar a danos nos sistemas biológicos e morte celular. Estudos recentes mostraram relação entre acumulação de ERO e aumento do estresse oxidativo com a osteoporose senil (MANOLAGAS, 2010; SHARMA et al.,2014). A osteoporose em mulheres na peri e na pós-menopausa está relacionada ao estresse oxidativo e redução da defesa antioxidante (CERVELLATI et al., 2014). Como forma preventiva, é consenso na literatura a eficácia do exercício físico em promover melhora na qualidade e massa óssea em mulheres na peri e pós-menopausa (MARTYN-ST JAMES,2010; BABATUNDE et al., 2012) tornando-se importante terapia não farmacológica que visa à promoção da saúde. Na tentativa de minimizar o acúmulo de danos oxidativos durante o envelhecimento, a atividade física tem sido considerada como estratégia capaz de melhorar a atividade antioxidante enzimática exercendo efeito sobre o equilíbrio redox (PINGITORE et al., 2015). Stringhetta-Garcia e colaboradores (2016) demonstraram que o TF foi estratégia eficaz em aumentar a densidade mineral óssea (DMO) e força óssea, além de melhorar a expressão de proteínas essenciais no processo de formação óssea em modelos de ratas com deficiência de estrógeno (ABDOLLAHI et al., 2005; ROMANO et al., 2010; CUI et al., 2012; DAI et al., 2014). Embora a literatura seja expressiva em relação ao uso do TF e análise do estresse oxidativo em organismos velhos, estudos que investiguem a relação entre o estado oxidativo e as respostas ósseas em organismos femininos naturalmente envelhecidos após realização de TF crônico são escassos. Diante da necessidade de buscar respostas para prevenção da osteoporose primária, surge a importância de se pesquisar e elucidar estes efeitos. Portanto, o objetivo do estudo é analisar se o TF influencia na qualidade óssea da região do colo do fêmur de ratas no período de periestropausa e a possível correlação com marcadores do estresse oxidativo, diminuindo os riscos de osteopenia e osteoporose primária, tendo como hipótese o TF como estratégia preventiva válida que reduz o estresse oxidativo e, consequentemente, melhora a qualidade óssea na região do colo do fêmur de ratas na periestropausa. 2. MATERIAIS E METÓDOS 2.1. Animais Foram utilizadas 20 ratas da linhagem Wistar com idade inicial de 18 meses. Os animais foram distribuídos em dois grupos, com dez animais cada: grupo controle (C) e o grupo de treinamento de força (TF). As ratas foram mantidas em gaiolas coletivas (4 animais/caixa) em ambiente com temperatura (22 ± 2°C), ciclo de luz (12/12h) e umidade (55 ± 10%) controlados e acesso livre à água e ração. O protocolo experimental foi enviado para análise ao Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA No 001568 2/2) da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba (FOA-UNESP) protocolo no 001568 2/2. Neste estudo foram utilizadas ratas de 18 meses com irregularidade do ciclo estral (periestropausa) (NICOLA et al., 2016). Para atestar esta irregularidade foi colhido o esfregaço vaginal por volta das 9h da manhã e analisado a fresco no microscópio óptico durante 2 semanas segundo a técnica de Long & Evans (1922). Após a confirmação, os animais receberam as seguintes intervenções durante 4 meses: Grupo C: nenhuma intervenção e grupo TF: treinamento de força 3 vezes por semana. 2.2. Treinamento de força Os animais do grupo TF realizaram treinamento de força em escada (1.1 3 x 0.18 m; 2 cm entre os degraus) com 80° de inclinação e local para descanso no topo (diâmetro de 20 x 20 x 20 cm) três vezes por semana, durante 120 dias, protocolo utilizado por StringhettaGarcia e colaboradores (2016). Os animais foram submetidos a um período de adaptação à escada por 3 sessões (primeira semana) quando realizaram 2, 4 e 6 séries em dias alternados e sem carga. Após o período de adaptação os animais foram submetidos a teste de capacidade de carga máxima voluntária (CCMV), com uso de esferas de aço acoplados à cauda. Para o CCMV, a carga inicial será 75% do peso corporal do animal. Os animais tiveram dois minutos de descanso entre as séries e a cada nova série a ser realizada foi adicionada trinta gramas de sobrecarga. Esse procedimento foi realizado até que o animal não complete inteiramente o movimento de subida. A sobrecarga imposta na subida anterior a da falha do movimento foi considerada a carga máxima do animal, a qual servirá como base para os cálculos da sobrecarga a serem aplicadas durante o período de treinamento, que foi iniciado quarenta e oito horas após o término do teste de CCMV. Durante 120 dias, os animais realizarão três sessões semanais de TF em dias alternados, cada sessão foi constituída por seis séries e intervalos dois minutos entre cada série. Durante a primeira semana os animais realizarão o treinamento com sobrecarga correspondente a 60% em relação ao teste de CCMV realizado, na segunda semana com 70% da sobrecarga correspondente ao CCMV e na terceira semana com 80%. A partir da 4a semana até o final do período proposto, os animais realizarão o TF com sobrecarga relativa a 80% do CCMV obtido na primeira avaliação. A cada 15 dias foi realizado novo teste de CCMV para a obtenção e manutenção da capacidade de força máxima dos animais. 2.3. Coleta de Materiais Após os 4 meses experimentais, foi coletado o peso dos animais foram pesados e receberam anestesia (cetamina 75 mg/kg de peso corpóreo e xilazina 10 mg/kg de peso corpóreo, intraperitoneal) de acordo com as Diretrizes da Prática de Eutanásia (Brasília/2013) do CONCEA. A coleta sanguínea foi realizada por punção cardíaca e o sangue obtido foi transferido para tubo heparinizado e centrifugado (plasma: 2.500 RPM; 15 min; 4oC). Após procedimento o sangue foi aliquotado e armazenado em freezer -80 °C para dosagem plasmática dos marcadores de estresse oxidativo. Além da coleta sanguínea, foi realizada a retirada asséptica dos fêmures direitos que foram armazenados em solução fisiológica (NaCl 0,9%) e em seguida em freezer -20oC para análise de microarquitetura óssea [micro-CT SkyScan 1272 (FINEP/CT-INFRA Convênio FINEP: 01.12.0530.00 – PROINFRA 01/2011)]. Após coleta sanguínea e óssea, o útero e ovários foram retirados e os pesos registrados. 2.4. Estresse oxidativo 2.4.1. Capacidade antioxidante total plasmática A capacidade antioxidante total plasmática foi determinada pelo poder antioxidante por redução férrica total ou “ferric reducing – antioxidante power” (FRAP) através do método descrito por (Benzie e Strain, 1996). A absorbância foi estimada a 595 nm e os resultados expressos em mmol/L,
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