Escolha e padronização de um protocolo de hemólise de amostras para extração de RNA.

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Ibelli, Adriana Mércia Guaratini Ribeiro, Ana Regina Bezerra Souza, J. R. T. Alencar, M. M. De Regitano, Luciana C. A.
Copyright Year	2009
Abstract	Estudos de regulacao da expressao genica dependem de amostras de RNA de alta pureza e integridade. A maioria das coletas de amostras para esses estudos ocorre a campo e, em grande parte das vezes, em diferentes momentos do experimento, exigindo que o transporte, a estocagem e o isolamento do RNA sejam adequados para que material de boa qualidade seja obtido. Dessa maneira, os objetivos deste trabalho foram: testar solucoes de hemolise existentes na literatura e verificar a qualidade do RNA extraido apos o processamento das amostras em diferentes tempos do experimento. Foram utilizadas amostras de sangue provenientes da Embrapa Pecuaria Sudeste, Sao Carlos, SP. Em um primeiro teste, dois protocolos de obtencao de leucocitos a partir de amostras de sangue total foram avaliados. No primeiro, as amostras foram mantidas em gelo e, entao, transferidas para um tubo de 15 mL, em que se adicionavam 10 mL de tampao de hemolise contendo 10 mM de Tris.HCl pH 7,6, 5 mM de MgCl2 e 10 mM de NaCl. A seguir, as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas por 10 min a 3000 rpm, por 2 ou 3 vezes. No segundo teste, apos a coleta, as amostras mantidas em gelo foram transferidas para tubo de 50 mL e centrifugadas por 5 minutos a 2500 rpm a 4oC. Apos descarte do plasma, a solucao de hemolise contendo 0,1444M de NH4Cl e 0,01M de NH4HCO3 foi adicionada, e as amostras foram agitadas vigorosamente, mantidas em gelo por cerca de 30 minutos e centrifugadas por 10 minutos a 3.000 rpm a 4oC. O sobrenadante foi descartado e essa etapa foi repetida uma vez. Em seguida, as extracoes de RNA foram feitas seguindo o protocolo tradicional do reagente Trizol (Invitrogen). Apos a escolha da melhor solucao hemolise, foi realizado um segundo teste com amostras de sangue processadas 20 minutos, 1 hora, 4 horas e 8 horas apos o horario inicial da coleta. Nos dois testes, as amostras foram quantificadas em espectrofotometro Nanodrop, para verificar a qualidade e a quantidade do RNA, e apos eletroforese gel de agarose 1%, para observar a integridade. Os resultados da eletroforese para o primeiro teste evidenciaram que o melhor metodo para obtencao de leucocitos foi com a solucao de hemolise contendo NH4Cl e NH4HCO3, ja que nao foi observada degradacao das amostras de RNA. Os resultados obtidos no segundo teste mostraram que nao houve diferenca na integridade do RNA apos eletroforese no intervalo de tempo de 20 minutos a 8 horas entre a coleta e o processa mento das amostras, que foram sempre mantidas em gelo. O mesmo foi observado quando o RNA foi mensurado no espectrofotometro, ja que todas as amostras apresentaram razao 260/280nm maior que 1,9 e quantidades maiores que 20 ?g. Pode-se dizer, entao, que amostras de sangue podem ser mantidas em gelo ate 8 horas antes de serem processadas para a extracao de RNA.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CPPSE-2010/18749/1/PROCIMMA2009.00185.pdf
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article