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Heterologe Überexpression, Reinigung, biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur Struktur der A1 ATPase aus Methanosarcina mazei Gö1
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Lemker, Thorsten |
| Copyright Year | 2002 |
| Abstract | 1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden fur die Studien dieser Arbeit eingesetzt. 2.Die fur die hydrophile Domane der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Archaons Methanosarcina mazei Go1 wurden in den Uberexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthalt zusatzlich 162 Bp stromaufwarts von ahaE 3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivitat im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSO1)betrug 186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)uber Ultra- zentrifugation,Ammoniumsulfatfallung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenitat gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im ATPase-Komplex eine Stochiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer wurde fur die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei Go1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhaltnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein und einem K von 1,3 ± 0,3 mM fur ATP. 8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archaellen A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch fur die Kopien der Untereinheit AhaB und fur die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer zentralen Masse zusammen. 11.Die uber Rontgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlange =17,8 nm,Lange Kopfteil =9,4 nm,Stiellange =8,4 nm, Stieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhangig vom Substrat)= 10,06 nm,Kopfradius (variabel,abhangig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich alkoholische Losungsmittel die ATPase-Aktivitat hemmten. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://edoc.ub.uni-muenchen.de/78/1/Lemker_Thorsten.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
