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Biochemische und röntgenkristallographische Untersuchungen an pflanzlichen 4-Hydroxyphenylpyruvat Dioxygenasen
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Fritze, Iris Maria |
| Copyright Year | 2003 |
| Abstract | 4-Hydroxyphenylpyruvat Dioxygenase (HPPD) ist ein ubiquitar verbreitetes Enzym, das eine wichtige Rolle beim Abbau aromatischer Aminosauren spielt und in Pflanzen am Prenylchinonsyntheseweg beteiligt ist. Das Enzym zahlt zu den mononuklearen Nicht-Ham-Eisen Proteinen, deren Aktivitat von einer α-Ketosaure abhangig ist. In dieser Klasse stellt die HPPD jedoch einen eigenstandigen Vertreter dar, weil sie im Unterschied zu weiteren α-Ketosaure abhangigen Enzymen beide Sauerstoffatome in ein einziges Substrat einbaut. Der benotigte Cofaktor liegt hier bereits als integraler Bestandteil des Substrates vor, wahrend andere Enzyme dieser Klasse in der Regel α-Ketoglutarat oxidieren, das anschliesend zu Succinat decarboxyliert wird. HPPD katalysiert die oxidative Decarboxylierung der Seitenkette von 4-Hydroxyphenylpyruvat, die von einer Hydroxylierung des aromatischen Rings und einer 1,2-Umlagerung der Carboxymethylgruppe begleitet wird. Das Reaktionsprodukt Homogentisat wird im Aminosaurekatabolismus weiter zu Fumarat und Acetoacetat abgebaut. In Pflanzen dient Homogentisat als Vorstufe fur die Plastochinon- und Tocopherolsynthese. Das HPPD-Gen aus Zea mays wurde kloniert, heterolog in E. coli unter stringenten Bedingungen exprimiert, gereinigt, kristallisiert und die Struktur des Enzyms (zmHPPD) bei einer Auflosung von 2 A unter Verwendung der Methode des Single Isomorphous Replacement (SIR) gelost. Diese Struktur ermoglichte mittels Molekularem Ersatz die Kristallstruktur der HPPD aus Arabidopsis thaliana (atHPPD) bei einer Auflosung von 3 A aufzuklaren. Die in dieser Arbeit ermittelten Strukturen sind die ersten Kristallstrukturen des Enzyms aus eukaryotischen Organismen. Die dimere Organisation unterschiedlicher eukaryotischer HPPDs, die bereits fruher durch biochemische Charakterisierungen bestimmt wurde, konnte dabei erstmals auf struktureller Basis bestatigt werden. Jedes Monomer wird durch zwei strukturelle Domanen aufgebaut, deren Faltungsmotive denen der 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase und Catechol 2,3-Dioxygenase ahneln, obwohl diese zur Klasse der extradiol ringspaltenden Dioxygenasen zahlen. Wie anhand der Sequenzhomologie zu erwarten war, weist der dreidimensionale Aufbau der Monomere grose Ahnlichkeit zu dem der HPPD aus Pseudomonas fluorescens auf. Im Unterschied zum bakteriellen Enzym sind jedoch andere Strukturbereiche an der Dimerisierung beteiligt. Insertionen von Aminosauren, besonders in der N-terminalen Sequenz, die durch fruher durchgefuhrte Sequenzvergleiche nicht als solche erkannt worden waren, sind an der Bildung der Dimerkontakte beteiligt. Die pflanzlichen Enzymstrukturen zeigen, das die C-terminale Helix als flexible Schranke den Zugang zum aktiven Zentrum regulieren kann, indem eine Rotation um Asn416 (zmHPPD) erfolgt. Die Architektur des aktiven Zentrums ist konserviert, was die sterischen Erfordernisse fur die Katalyse der mehrere Schritte umfassenden Reaktion widerspiegelt. Das Eisenatom im aktiven Zentrum wird in HPPD durch zwei Histidin- und einen Glutamatrest koordiniert, wobei in zmHPPD dessen oktaedrische Koordination nachgewiesen werden konnte. Die losliche anorganische Pyrophosphatase (PPase) aus Heliothis virescens wurde kristallisiert und das Atommodell bei einer Auflosung von 2,1 A verfeinert, die Struktur wurde durch Molekularen Ersatz mit Hefe PPase als Suchmodell gelost. Dieses Enzym ist zur Kontrolle der intrazellularen Pyrophosphatkonzentration wichtig, weil anorganisches Pyrophosphat bei vielen Biosynthesereaktionen freigesetzt wird. Dessen Hydrolyse durch PPase treibt diese Reaktionen thermodynamisch an und macht sie irreversibel. Zur Katalyse benotigt das Enzym divalente Metallcofaktoren. Die Kernstruktur des dimer organisierten Enzyms besteht aus einem verdrehten β-Barrel, welches von α-Helices umgeben ist und das aktive Zentrum enthalt. Dieses befindet sich in einer Vertiefung von etwa 20 A Durchmesser. Wie in den Strukturen des Enzyms aus E. coli und S. cerevisiae konnte gezeigt werden, das die Bindung von zwei Mg 2+ -Ionen bereits vor der Substratbindung erfolgt. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://mediatum.ub.tum.de/doc/601281/601281.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
