Loading...
Please wait, while we are loading the content...
Similar Documents
Interaction of tumor necrosis factor-alpha with an antibody and of albumin with cholate investigated by FTIR attenuated total reflection spectroscopy
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Hassler, Norbert |
| Copyright Year | 2008 |
| Abstract | FTIR-Spektroskopie, kombiniert mit der Methode der abgeschwachten Totalreflexion (ATR), wird zunehmend zur Erforschung von oberflachennahen Vorgangen benutzt. Zur Untersuchung von Biomembranen, Monoschichten und dunnen Filmen werden sehr empfindliche Methoden benotigt, um deren Oberflachenkonzentrationen und molekulare Strukturen zu bestimmen. In dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zweier Proteine untereinander und eines Proteins mit einem Liganden, die in einer phosphatgepufferten Saline (PBS) gelost waren, untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei Techniken angewendet: die single-beam-sample-reference (SBSR) Spektroskopie und die konzentrationsmodulierte Anregungs-(c-ME)-Spektroskopie. Gemeinsam fuhren diese zu optimaler Hintergrund¬kompensation und verbessertem Signal-Rausch-Verhaltnis. Im ersten Teil wird die Erkennung des immobilisierten humanen Tumornekrosefaktors-alpha (TNF-alpha), eines wichtigen Vermittlers der zellularen Immunantwort, durch den monoklonalen Antikorper Infliximab beschrieben. Rinderserumalbumin (BSA) wurde verwendet, um die unspezifische Bindung des Antikorpers an das multiple interne Reflexionselement (MIRE) zu verhindern. Die durch die SBSR-Technik erhaltenen Spektren ermoglichten die Unterscheidung der beteiligten Proteine auf Grund ihrer unterschiedlichen Amid-Banden. Das molekulare Bindungsverhaltnis zwischen immobilisiertem TNF-alpha und dem spezifisch gebundenen Antikorper betrug 5.3. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung von Cholat mit adsorbiertem humanem Serumalbumin (HSA) untersucht. Cholat gehort zu den Gallensauren und ist ein Ligand von HSA, dem am haufigsten vorkommenden Protein im Blut. Um die reversible Reaktion von immobilisiertem HSA auf periodische Konzentrationsanderungen von Cholat zu bestimmen, wurde c-ME-Spektroskopie angewendet. Die Antwort des Protein-Ligand-Systems wurde dabei mittels zeitaufgeloster FTIR-Spektroskopie gemessen und die anfallenden Daten einer phasen-sensitiven Detektion (PSD) unterworfen. Dadurch konnten storende Signalkomponenten, die nicht die gleiche Frequenz wie die Anregung hatten, eliminiert werden. Die erzielte Empfindlichkeit lag im Mikro-Absorbanzbereich, was eine Grundbedingung darstellt, um spezifische Wechselwirkungen auf molekularem Niveau aufzulosen. Um Informationen uber Bindungskapazitat und Bindungsverhalten zwischen immobilisiertem Serumalbumin und Cholat zu erhalten, wurden die Modulationsexperimente mehrere Male im Cholatkonzentrationsbereich zwischen 0.3 mM und 20 mM durchgefuhrt. Dabei konnte eine Zunahme alpha-helikaler Strukturen von HSA als Folge der Cholatbindung beobachtet werden. Bindungskurven konnen auch durch Surface-plasmon-resonance (SPR) erhalten werden. Obwohl die c-ME Spektroskopie hoheren experimentellen Aufwand als SPR erfordert, liegt ihr Vorteil im Zugang zu Informationen uber strukturelle Anderungen im Rezeptor, die durch die Ligandenbindung verursacht wurden. Der Hintergrundkompensation wurde besondere Aufmerksamkeit gewidmet, um uberlappende spektrale Beitrage von gelostem und an HSA gebundenem Cholat zu trennen. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | http://othes.univie.ac.at/4412/1/2008-12-09_8604177.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
