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Charakterisierung von RNA-Aptameren mit Spezifität für den humanen Interleukin-6-Rezeptor
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Eydeler, Katja |
| Copyright Year | 2011 |
| Abstract | Zytokine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation zahlreicher Zellfunktionen. Ihre Bindung an spezifische Rezeptorkomplexe lost intrazellulare Signaltransduktionswege aus, die das Wachstum und die Differenzierung ihrer Zielzellen beeinflussen. So nimmt Interleukin-6 (IL-6) eine Schlusselstellung bei der Wechselwirkung des angeborenen und des erworbenen Immunsystems ein. Seine Funktion als Botenstoff ubt IL-6 durch die Bindung an einen IL-6-Rezeptorkomplex aus. Dieser besteht aus dem eigentlichen IL-6-Rezeptor (IL-6R) und zwei Einheiten des Glykoproteins gp130 [3]. Der Rezeptorkomplex unterliegt standigen Recycling-Prozessen, wobei die Endozytose durch die Bindung von IL-6 beschleunigt wird. Mittels eines in vitro Evolutionsprozesses konnten RNA-Aptamere mit Spezifitat fur den loslichen IL-6R isoliert und auf das minimale Bindemotiv reduziert werden. Somit konnte das hochspezifische Aptamer 16-3A (19 nt) generiert werden, welches das tertiare Strukturmotiv eines G-Quadruplexes annimmt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Charakterisierung des Aptamers 16-3A im Hinblick auf die fur die Bindung essentiellen Basen und die Moglichkeit, das Aptamer als Vehikel fur den Zell-spezifischen Transport zu nutzen. Uber Filterbindungsstudien und Messung der Oberflachenplasmonresonanz (SPR) konnte eine Dissoziationskonstante von 67 nM (Filterbindungsstudie) bzw. 9 nM (SPR) fur das Aptamer 16-3A ermittelt werden. Anhand von Mutationsanalysen wurde der Einfluss einzelner Basen auf die Bindung zwischen dem Aptamer 16-3A und dem IL-6R untersucht. Dabei erwiesen sich funf der elf analysierten Basen als essentiell. Das Einfuhren eines 2‘-F-Cytosins fuhrte hingegen nicht zum Verlust der Affinitat, konnte die Stabilitat des Aptamers in Serum-enthaltenem Medium aber nur geringfugig steigern. Mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte nicht nur die Bindung des Aptamers 16-3A an den membranstandigen IL-6R, sondern auch die Rezeptorvermittelte spezifische Internalisierung des Aptamers nachgewiesen werden. Dabei wurde gezeigt, dass die intrazellulare Aufnahme des Aptamers nicht von IL-6 abhangig ist und weder einen pro- noch anti-proliferierenden Effekt auf IL-6R-tragende Zellen ausubt. Eine kovalente Verknupfung des Aptamers mit siRNAs fuhrte zu keiner Beeintrachtigung der Affinitat zwischen dem Aptamer und dem IL-6R, wie anhand von Filterbindungsstudien und Durchflusszytometrie gezeigt wurde. Des Weiteren konnten diese Chimaren in in vitro Studien durch rekombinanten Dicer prozessiert werden. Der Nachweis einer Herabregulierung der Zielgene der Chimaren, murines STAT3 und murines STAT5 nach Transfektion bzw. nach erfolgter Rezeptor-spezifischer Aufnahme, war hingegen mittels einer Western-Blot-Analyse nicht moglich. Erhohte IL-6 Konzentrationen bzw. eine Dysregulation der loslichen Formen des Rezeptorkomplexes spielen bei verschiedenen Erkrankungen eine Rolle. Eine mogliche therapeutische Anwendung bietet die Inhibierung des IL-6 vermittelten Signalweges. In folgenden Studien bleibt zu klaren, ob die Stabilitat des Aptamers 16-3A gegen uber Ribonukleasen durch weitere postselektive Modifikationen gesteigert werden kann. Dies wurde eine systemische Anwendung des Aptamers in Konjugation mit Liganden wie Toxinen oder therapeutisch wirksamen siRNAs ermoglichen. Auch eine markierende Wirkung des Aptamers fur die in vivo Detektion des loslichen oder membranstandigen IL-6-Rezeptors konnte so erreicht werden. Cytokines play an important role in the regulation of numerous cellular functions. Their binding to specific receptor complexes triggers signal transduction pathways which affect the growth and differentiation of their target cells. Interleukin-6 (IL-6) enters a key switch position in the interaction of the innate and adaptive immune system. The cytokine exerts its function after binding to an IL-6 receptor complex. This consists of the IL-6 receptor (IL-6R) and two units of the glycoprotein gp130. The receptor complex is subject to constant recycling processes, where the endocytosis is accelerated by the binding of IL-6. The application of an in vitro evolutionary process enabled the isolation of RNA-aptamers with specificity for the soluble IL-6R. The Aptamers were shortened to the minimal binding motif and the G-rich Aptamer 16-3A was identified. This 19 nt long variant adopts the structure motif of a guanine quadruplex. The present work describes the characterization of the aptamer 16-3A with respect to the bases essential for binding between the Aptamer and the target protein. Further the possible use of the aptamer as a vehicle for the cell-specific transport of siRNAs was investigated. It turned out that five of the eleven bases analyzed were as essential for affinity as measured by filter binding assays and surface plasmon resonance (SPR). A dissociation constant of 9 nM for SPR-measurements and of 67 nM for filter binding studies was obtained for the RNA-Aptamer 16-3A. The introduction of a 2'-F cytosine at position 8 however did not lead to the loss of affinity but could increase the stability of the aptamer in serum-containing medium only slightly. By flow cytometry and confocal fluorescence microscopy the binding of the aptamer 16-3A to the membrane-bound IL-6R was determined. Furthermore the specific receptor-mediated internalization of the aptamer could be detected. It was shown that the cellular uptake of the aptamer was not dependent on IL-6, and neither pro- nor anti-proliferative effects on IL-6R bearing cells occurred after aptamer-binding or -internalization Covalent linkage of the aptamer with siRNAs did not affect the affinity between the aptamer and the IL-6R, as it was shown by filter binding studies and flow cytometry. Additionally, these chimeras were processed by recombinant human Dicer as shown by in vitro studies. A down-regulation of target genes of the chimeras, murine STAT3 and murine STAT5 after transfection or after receptor-specific uptake was, however, not be detected by Western-Blot analysis. Increased IL-6 concentrations and a dysregulation of the soluble forms of the receptor complex play a role in various diseases. A possible therapeutic application is the inhibition of the IL-6 mediated signaling pathway. In prospective studies it remains to be determined whether the stability of the aptamer 16-3A against ribonucleases can be increased by further post-selective modifications without loss of affinity. This would approve a systemic application of the aptamer in conjugation with ligands such as toxins or therapeutically effective siRNAs. Also, a marking effect of the aptamer for the in vivo detection of soluble or membrane-bound IL-6 receptor could be helpful. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://d-nb.info/1020383755/34 |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
