Estudi d'un receptor quinasa atípic (Mark) i de les proteïnes que interaccionen amb el seu domini intracel·lular. Transducció del senyal i desenvolupament en blat de moro (Zea mays)

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Royo, Blanca Llompart I
Copyright Year	2002
Abstract	Aquesta tesi doctoral sengloba dins dun projecte general destudi de gens implicats en lembriogenesi del blat de moro. Lembriogenesi del blat de moro, i en general la de totes les plantes superiors, es dona en tres etapes: una primera etapa on es diferencien tots els diversos teixits que formaran lembrio, una segona etapa on lembrio acumula productes de reserva i un tercer periode, la dormancia, que finalitza quan les condicions ambientals son les idonies per a la germinacio. En el laboratori estavem interessats, concretament, en lestudi de gens implicats en la primera etapa morfogenetica, on els diferents teixits i estructures embrionaries queden definides. Per tal destudiar gens que sexpressaven en aquest periode, una de les estrategies que es va realitzar fou un crivellat diferencial entre teixit embrionari i teixit de planta adulta. Dentre els diferents clons obtinguts, un corresponia a un clon parcial que presentava similitud amb receptors quinasa i que fou objecte destudi. A partir daquest clon es va obtenir el clon complet i es va anomenar MARK (per Maize Atypical Receptor Kinase). MARK presenta una estructura tipica dun receptor quinasa amb un domini extracel.lular, que conte 6 copies imperfectes de LRR (Leucine- Rich Repeats), un unic domini transmembrana i un domini quinasa intracel.lular. El domini quinasa de MARK presenta, pero, algunes variacions en els residus aminoacidics que es consideren claus per a la funcio catalitica dels dominis quinasa. En concret cinc dels aminoacids considerats essencials per a la fosforilacio es troben substituits en el domini quinasa de MARK (DK-MARK). Els experiments de fosforilacio in vitro que es van realitzar al laboratori, van mostrar com MARK era incapac de fosforilar in vitro. Aquesta caracteristica no es, pero, exclusiva de MARK. Una busqueda en les bases de dades ens van permetre identificar altres sequencies que tambe presentaven els mateixos o altres canvis en aquestes posicions aminoacidiques. En les bases de dades de plantes es van identificar un conjunt de sequencies genomiques o ESTs amb aquestes caracteristiques i nomes una delles, la proteina TMKL1 dArabidopsis, ha sigut descrita com un receptor quinasa incapac de fosforilar in vitro. Respecte a la busqueda de receptors similars a MARK en les bases de dades danimals, es van identificar tambe un conjunt de proteines que, en alguns casos, sha descrit que no tenen activitat quinasa in vivo. Per exemple, un dels casos mes ben estudiats es el del receptor erbB3 que forma part de la familia de receptors del EGF (Epidermal Growth Factor). Aquesta familia de receptors esta formada per 4 receptors: erbB1, erbB2, erbB3 i erbB4, dels quals nomes lerbB3 no presenta activitat catalitica. Sha descrit que erbB3 es capac, tot i no fosforilar in vivo, de participar activament en la transduccio del senyal formant heterodimers amb els altres membres de la familia. Aixi, erbB3 es fosforilat pel seu partner i pot iniciar la cascada de transduccio del senyal. La participacio derbB3 en la transduccio del senyal es essencial ja que embrions de ratoli knock-out pel gen erbB3 son inviables. Aixi doncs, el fet que receptors quinasa cataliticament inactius participin en les cascades de transduccio del senyal, suggereix lexistencia de nous mecanismes daccio per a la transduccio del senyal. Per tant, lobjectiu daquest treball fou lestudi del mecanisme daccio de MARK mitjancant la caracteritzacio les proteines capaces dinteraccionar amb el seu domini quinasa. Per tal dassolir aquest objectiu, es va realitzar un crivellat de doble-hibrid amb una llibreria de cDNA dembrions de blat de moro de 7 DAP. Daquest crivellat es va obtenir un conjunt de possibles clons positius que foren sequenciats i entre els quals es van escollir per un estudi mes detallat aquells que shavien obtingut mes vegades com a clons independents. Aquests clons codificaven per: una SAMDC (S-Adenosil Descarboxilasa), una eIF5 (Eukaryotic translation initiation), una hypothetical protein, una unknown protein, una gamma-adaptina i una MAP4K. Amb aquests 6 clons es van fer estudis in vitro i in vivo per tal de confirmar al seva interaccio amb DK-MARK. Els estudis in vivo es van realitzar amb la soca de llevat AH109, una soca mes astringent que la utilitzada en el crivellat, ja que presenta tres gens marcadors: Histidina, Adenina i Lacz. Els resultats obtinguts van mostrar que els clons codificants per SAMDC i eIF5 no van creixer en un medi selectiu per His i Ade i, per tant o es tracta de falsos positius del sistema o la seva interaccio amb DK-MARK es debil. Daltra banda, la resta dels clons analitzats (proteina hipotetica, una proteina de funcio desconeguda, la gamma-adaptina i una MAP4K) van creixer en medis en absencia de Histidina i Adenina. Els assatjos de b-galactosidasa van ser tots positius a excepcio de la proteina hipotetica suggerint que potser aquesta interaccio sigui mes feble. Daltra banda tambe es van realitzar estudis in vitro amb la tecnica del pull-down. Els resultats obtinguts amb aquesta tecnica van recolzar els obtinguts en cel.lules de llevat, ja que tots els clons analitzats a excepcio dels codificants per SAMDC i eIF5 van donar un resultat dinteraccio amb KD-MARK in vitro positiu. Davant aquests resultats ens vam centrar en lestudi de la proteina similar a MAP4K, doncs algunes proteines de la seva familia shan relacionat amb receptors de membrana. Els clons que es va obtenir del crivellat codificaven per una proteina similar amb el domini C-terminal a les proteines BnMAP4Ka1 i a2 de Brassica napus. Aquestes proteines presenten una forta similitud de sequencia amb proteines de la familia GCK/SPS1 que formen part dun grup particular de MAPK relacionades amb la proteina Ste20 (sterile 20 protein) de llevat. Ste20p activa la MAP3K de llevat Ste11 directament per fosforilacio, transduint daquesta manera el senyal del receptor de feromones de creuament de les cel.lules de llevat i es pot, doncs, considerar com una proteina del tipus MAP4K (mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase). En els darrers anys, shan identificat un gran nombre de proteines similars a Ste20: fins a una trentena en mamifers, en Drosophila, en Caenorhabditis elegans i en altres organismes. Segons la seva estructura aminoacidica, la familia Ste20 sha classificat en dues subfamilies: les proteines STE20/PAK (p21-activated kinases) i la subfamilia GCK/SPS1 (germinal center kinases). Les dues subfamilies estan formades per proteines que contenen un domini quinasa i un domini regulador, pero, mentre que les proteines PAK presenten el domini quinasa en la part C-terminal, les GCKs el presenten en la regio N terminal. Les proteines GCK presenten una elevada diversitat estructural en el domini regulador permetent la seva classificacio en 6 subfamilies. Mitjancant la tecnica del RACE es va obtenir el clon de cDNA complet que es va anomenar MIK (MARK Interacting Kinase). Amb la tecnica del Southern blot es va poder determinar que el gen MIK es un gen de copia unica en el genoma de blat de moro. Per tal danalitzar la possible interaccio entre DK-MARK i MIK, es va estudiar tant el patro dexpressio dambdos gens com el seu patro dacumulacio dambdues proteines durant lembriogenesi del blat de moro. El patro dexpressio, analitzat per Northen blot va mostrar uns patrons coincidents al llarg de lembriogenesi des del seu inici fins als 20 DAP amb una acumulacio maxima de mRNA en embrions de 15 DAP. Daltra banda per tal destudiar el patro dacumulacio de la proteina MIK aixi com per comparar-lo amb el de MARK, es van realitzar estudis de Westerns blot. Els resultats tambe van mostrar una coincidencia en el temps de lacumulacio de les proteines MARK i MIK durant lembriogenesi de blat de moro amb una major acumulacio en embrions de 15 i 20 DAP. Es van dur a terme tambe estudis dimmunolocalitzacions sobre embrions de blat de moro de 15 DAP per tal destudiar en quins teixits sacumulaven ambdues proteines. Les immunolocalitzacions van mostrar una major acumulacio tant de MARK com de MIK en les zones meristematiques i en el teixit vascular sobretot del coleoptil on saprecia una forta co-localitzacio de MARK i MIK. Totes aquestes dades son compatibles, doncs, amb una possible interaccio de les proteines MARK i MIK, tot i que no la demostren. Per tal de demostrar la interaccio es van realitzar experiments dimmunoprecipitacio in vivo a partir dextractes dembrions. Malauradament, els resultats no son clars i en aquests moments en el laboratori sestan posant a punt aquests experiments. Tambe es van realitzar estudis comparatius de sequencia amb diferents proteines de la familia GCK, mostrant una major similitud amb les proteines de la subfamilia GCK-III. La subfamilia GCK-III ha estat molt poc estudiada i en formen part un conjunt de proteines amb funcions molt diverses des de lapoptosi, la citoquinesi o lanoxia cel.lular. Per tant, la similitud de sequencia possiblement fa referencia a una conservacio en el mecanisme daccio mes que no pas a una conservacio funcional. La possible interaccio de MARK amb el domini C-terminal de MIK (el domini regulador) podria activar aquesta ultima iniciant una cascada de transduccio del senyal en un model en el que una proteina del tipus GCK-III faria de lligam directa entre un receptor de membrana i una cascada de senyalitzacio intracel.lular. Aquest tipus de lligam entre un recepctor de membrana i moduls intracel.lulars de senyalitzacio sha descrit per a altres proteines GCK, si be no directament sino a traves de proteines adaptadores. Daltra banda, la interaccio directa de MARK, un receptor quinasa atipic que no te activitat catalitica, amb MIK suggereix un mecanisme on receptors atipics podrien interaccionar en la transduccio del senyal activant la via de les MAPK.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	https://dugi-doc.udg.edu/bitstream/handle/10256/4551/tblr.pdf?isAllowed=y&sequence=5
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article