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Contribution à l'étude de la séparation des protéines par chromatographie d'échange d'ions en milieu complexe. Effet du poids moléculaire sur l'équilibre et la cinétique de rétention
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Wakkel, Manel |
| Copyright Year | 2015 |
| Abstract | La separation et la purification de biomolecules a partir de milieux bruts, vegetaux ou biologiques, est un sujet vaste etcomplexe. De sa comprehension et de son developpement dependent des enjeux industriels, et notamment le completdeveloppement des procedes biotechnologiques, les procedes de separation, ou downstream processes, constituant environ 80% des couts totaux de ces procedes. Ce travail se veut une contribution a ces problematiques. Il a ete motive par des resultatsobtenus au prealable dans le laboratoire qui montraient qu'il est possible de recuperer une proteine de tres grande taille apartir d'un milieu reel vegetal par l'application d'une seule operation chromatographique (Kerfai, 2011). Suite a ce resultat,des hypotheses ont ete enoncees, auxquelles ce travail essaie de repondre : quel(s) mecanisme(s) peuvent expliquer ceresultat ? Existe-t-il une localisation specifique pour la fixation de la molecule sur l'echangeur d'ions qui rend plus simple etefficace sa recuperation lors de l'etape d'elution ? Ainsi, notre objectif a ete de progresser dans la connaissance des aspectsfondamentaux de la chromatographie d'echange d'ions appliquee a la separation des proteines a partir d'un milieu brut.Notamment, l'influence de la presence d'autres proteines dans le milieu a ete analysee, et ce dans le cas particulier deproteines de poids moleculaire tres differents, comme c'etait le cas dans le travail precedemment cite. Des approches variees,theoriques et experimentales a differentes echelles sur des milieux reels ou synthetiques, ont ete appliquees et parfoisdeveloppees, pour essayer de repondre a ces questions. A l'echelle du procede, une methode statistique d'analyse desdonnees (Analyse en Composantes Principales ou ACP) a ete menee, dont l'exploitation reste delicate. A l'echelle dulaboratoire, l'etude de l'equilibre et de la cinetique d'echange d'ions a ete menee sur des solutions synthetiques de deuxproteines : la serum albumine bovine (BSA) (en tant que proteine de reference, couramment etudiee) et la ferritine (proteinede stockage du fer) de point isoelectrique proche de celui de la BSA mais de masse molaire plus elevee. Les resultatsmontrent que des modeles relativement classiques peuvent etre appliques, y compris pour les proteines de tres grandes tailles,pour expliquer les aspects cinetiques de l'echange. Le couplage des flux de matiere des proteines a l'interieur des particulesde l'echangeur est tres probable, malgre des diffusivites tres differentes. Interpreter les resultats d'equilibre reste bien plusardu. La concentration en sel ou la presence de la BSA n'ont que tres peu d'effet sur la retention de la ferritine a l'equilibre.En revanche, la presence de la ferritine affecte tres fortement la retention de la BSA (pourtant plus favorable). Parmi lesphenomenes suggeres dans la litterature, l'effet Vroman a ete recherche, mais il n'a pas ete constate dans le systeme pour lesconditions de travail utilisees. Les isothermes d'adsorption en conditions competitives n'ont pas pu etre simulees par lesmodeles habituels (comme l'isotherme multi-constituants de Langmuir), alors que celles des proteines seules sont tout a faitclassiques. En outre, un blocage partiel des pores de la resine par la ferritine reste probable, empechant la diffusion de laBSA. Afin de verifier ce dernier point, une methodologie a ete developpee afin d'observer a l'echelle microscopique lesprofils de concentration des elements representatifs du systeme (P, Fe, Cl…) dans les particules. Cette methode qui se trouvea un stade tres avance de developpement, n'a pas encore permis de conclure faute de sensibilite suffisante des sondes adisposition. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01230948/document |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
