Charakterisierung und Optimierung von FMN-bindenden Fluoreszenzproteinen als molekulare Reporterproteine

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Wingen, Marcus
Copyright Year	2017
Abstract	Uber die letzten zwei Jahrzehnte hinweg haben sich Fluoreszenzproteine zu einem Grundpfeiler in der modernen Erforschung biologischer Systeme entwickelt. Sie konnen verwendet werden, um zum Beispiel Genexpressionen, Proteinlokalisationen oder komplexe zellphysiologische Prozesse zu studieren. Die groste Klasse von Fluoreszenzproteinen bildet die GFP-Familie, deren zahlreiche Varianten von Proteinen aus der Qualle A. victoria und verschiedenen Anthozoa-Spezies abgeleitet sind. FMN-bindende Fluoreszenzproteine (FbFPs), die vor wenigen Jahren aus blaulichtsensitiven LOV-Domanen, die in Pflanzen und vielen Bakterien bekannt sind, entwickelt wurden, bilden eine weitere Klasse von Fluoreszenzproteinen, die die Sammlung der vorhandenen Fluoreszenzproteine durch ihre Unabhangigkeit von molekularem Sauerstoff komplementiert. In dieser Arbeit wurden neuartige FbFP Varianten erzeugt und charakterisiert, die neue und einzigartige Eigenschaften aufweisen. Die beiden etablierten Proteine EcFbFP und Pp2FbFP wurden durch Zufalls- und ortsgerichtete Mutagenese verbessert, um Varianten mit erhohter in vivo Fluoreszenz, blauverschobenen Spektren und – im Falle von Pp2FbFP – mit einer erhohten Fluoreszenz-Quantenausbeute hervorzubringen. Um FbFPs mit rotverschobenen Emissionsspektren hervorzubringen, wurden alle verfugbaren FbFPs auf die Fahigkeit hin untersucht, das Flavinanalogon Roseoflavin zu binden und ein rotverschobenes Fluoreszenzsignal zu erzeugen. In diesen Studien konnte gezeigt werden, dass Pp1FbFP RoFMN effizient binden kann, wodurch ein helles Fluoreszenzsignal mit einem Emissionsmaximum bei λ = 540 nm erzeugt wird, was eine signifikante Rotverschiebung verglichen mit FbFPs mit FMN darstellt. Die Fahigkeit des Proteins, zwei verschiedene Chromophore mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften zu binden, macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten fur die Entwicklung eines FbFP-basierten Sekretionsmarkers. Um die Anwendbarkeit von Fluoreszenzproteinen auf das Gebiet der oftmals anaerob lebenden thermophilen Organismen auszuweiten, wurde eine Reihe neuartiger FbFPs aus LOV-Domanen entwickelt, die in solch Thermophilen gefunden wurden. Mit Schmelztemperaturen von > 75 °C weisen diese Proteine eine signifikant hohere Thermostabilitat als andere FbFPs auf und sollten theoretisch stabil genug fur die Anwendung als Fluoreszenzreporter in thermophilen Organismen sein.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DerivateServlet/Derivate-38726/Dissertation%20Marcus%20Wingen-1.pdf
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article