Test de génotypage plaquettaire in vitro à base de sandwich de microparticules biofonctionnalisées : Détection par capteur de fluorescence à ondes évanescentes, imagerie de fluorescence et cytométrie en flux

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Cornillon, Amandine
Copyright Year	2014
Abstract	Cette these porte sur l’elaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation genetique (SNP) grâce a la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisees avec des oligonucleotides couplee a une detection de la fluorescence. Le modele biologique choisi pour ce projet est le genotypage plaquettaire et plus particulierement la recherche du gene biallelique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a ete d’optimiser un outil de capture prealablement developpe dans l’equipe (Trevisan, 2011) afin de reduire le nombre d’etapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moleculaires utilisee pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme element de detection. En presence d’ADN cible, des sandwichs sont formes entre les particules fluorescentes et les particules magnetiques biofonctionnalisees. Ces sandwichs sont purifies par separation magnetique et la fluorescence est detectee par trois methodes : la cytometrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (detection par ondes evanescentes). Dans un premier temps, les parametres de fonctionnalisation chimique et biologique des differentes particules (magnetiques et fluorescentes) ont ete determines et optimises ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur detection ont ete suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois methodes differentes : la cytometrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur a ondes evanescentes). Les resultats obtenus avec les differentes methodes de detection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN developpe permet de capturer la cible synthetique (oligonucleotide) HPA-1 en reduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allele a de l’allele b du gene HPA-1 qui ne differe que d’un nucleotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich specifique et du sandwich non specifique est d’environ 2,5 a 3. Ce rapport devra etre ameliore par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine etape consistera a optimiser le systeme de capture d’ADN developpe pour gagner en specificite et determiner la limite de detection du test. Ce test devra egalement etre valide avec des echantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra etre detectee par un photodetecteur miniaturise actuellement developpe a l’Universite de Sherbrooke. Des etudes preliminaires presentees dans ce manuscrit montrent les potentialites de ce nouveau transducteur.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01146422/document
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article