Untersuchungen zum Einfluss von bFGF auf die Retinogenese des Huhns in einem dreidimensionalen in vitro Zellkultursystem

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Frohns, Florian
Copyright Year	2009
Abstract	Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer Methoden fur die Kultivierung und die Auswertung von Spharoidkulturen. Den ersten Schritt auf diesem Weg stellen die in dieser Arbeit erstmals angewandten Verfahren fur die Verarbeitung von Informationen aus immunhistochemischen Farbungen der Spharoidschnitte dar, welche bis heute fur die Analyse von Spharoiden unersetzlich sind. Bislang hatten solche Farbungen jedoch den Nachteil, dass die in ihnen enthaltenen Informationen – wenn uberhaupt - nur schlecht quantifzierbar waren, da der Auswertungsprozess stets mit einem sehr hohen Zeitaufwand verbunden und zudem fehleranfallig war. Dementsprechend basierten die bisherigen statistischen Analysen, die anhand von Spharoidkulturen gewonnen wurden, lediglich auf einer begrenzten Datenmenge. Diese Mangel konnten anhand der im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden weitgehend beseitigt werden. Die hier angewandte computergestutzte Analyse von Farbungen an Spharoidschnitten ermoglichte erstmals die statistische Auswertung des Einflusses eines Wachstumsfaktors auf die Spharoidentwicklung auf der Basis umfangreicher mikroskopischer Datensatze. Zusatzlich konnte die Quantifizierung der Unterschiede zwischen unter-schiedlich behandelten Spharoiden um einen neuen Aspekt erweitert werden. Wahrend bislang lediglich gesicherte Aussagen uber Veranderungen in der Anzahl bestimmter Zelltypen in den Spharoiden getroffen werden konnten, steht nun mit dem Scaling2.0-Makro ein Instrument fur die Quantifizierung struktureller Differenzen zur Verfugung. Aber nicht nur die Auswertung der Farbungen von Spharoidschnitten, auch die Analyse von sich noch in der Kultur befindenden whole-mount-Spharoiden konnte im Rahmen dieser Arbeit auf ein neues Niveau gehoben werden. Erstmals wurde nicht nur die Grose, sondern auch die Form von Spharoiden anhand ihres Zirkularitatswerts quantifiziert. Diese Neuerungen eroffneten die Moglichkeit, die Analyse der Einflusse von bFGF auf die Entwicklung von Rosettenspharoiden auf eine breite Auswahl unterschiedlicher Marker auszuweiten, ohne dadurch die Menge an ausgewertetem Material zu reduzieren. Die Resultate dieser Untersuchungen haben gezeigt, dass bFGF eine Vielzahl von biologischen Funktionen in dem sich entwickelnden Verband von Retinazellen ausubt. Zu den Funktionen, die im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden konnten, gehort unter anderem die Regulation des Differenzierungsprozesses von Photorezeptoren. Dies erfolgt durch die Verlangerung der transienten Islet2-Expressionsphase. Dadurch wird der Eintritt der Zellen in den letzten Abschnitt der Photorezeptorenreifung, welcher durch die Expression von Opsinen gekennzeichnet ist, verzogert. Im ausdifferenzierten Zustand ubernimmt bFGF daruber hinaus eine Schutzfunktion vor Apoptose fur die Photorezeptoren. bFGF wirkt jedoch nicht nur direkt auf bereits geborene Photorezeptoren und deren Vorlaufer. Vielmehr reguliert es auch den Anteil dieses Zelltyps an der Gesamtpopulation von Retinazellen in den Spharoiden. Dies wird offenbar dadurch erreicht, dass bFGF die Differenzierung von nicht determinierten Vor-lauferzellen in Richtung der inneren Retina verschiebt. Diese Verschiebung hat zur Folge, dass sich der Organisationsgrad der IPL-Bereiche in den Reaggregaten erhoht. An diesem Punkt ist es wichtig zu erwahnen, dass diesen histotypischen Bereichen der Spharoide in vorangegangenen Arbeiten bislang wenig Aufmerksamkeit gewidmet wurde. Dabei hat die Vermessung der Zirkularitat von Spharoiden an den unterschiedlichen Kulturtagen gezeigt, dass ihnen u. a. eine entscheidende Rolle bei der morphologischen Entwicklung der Spharoide zukommt. Somit kann auch diese neue Methode als ein Erfolg angesehen werden. Durch bestimmte Stoffe induzierte Veranderungen der IPL-Bereiche konnen mit ihrer Hilfe bereits vor der Analyse von Antikorperfarbungen festgestellt werden. Aber nicht nur uber die Rolle der IPL-Bereiche bei der morphologischen Entwicklung, auch uber ihre innere Strukturierung konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse erlangt werden. Tatsachlich weisen diese histotypischen Strukturen deutlich grosere Ubereinstimmungen mit der in vivo Situation auf, als bislang angenommen wurde. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit unter anderem an der erstmals gezeigten Entwicklung der fur die Vogelretina charakteristischen drei Typen von cholinergen Amakrinzellen gezeigt werden. All diese Ergebnisse machen erneut deutlich, dass es sich bei Rosettenspharoiden um ein Kultursystem handelt, mit dem sich sowohl die Entwicklung der Retina als Ganzes, als auch der Einfluss von einzelnen Zytokinen auf diesen Prozess nachvollziehen lasst. Dass sich im Hinblick auf den letzten Punkt teilweise deutliche Abweichungen zu bereits publizierten Daten aus zweidimensionaler Kulturtechnik zeigen, unterstreicht die Bedeutung der dreidimensionalen Kultivierung von Zellen und deren fortlaufende Weiterentwicklung bezuglich Methodik und Auswertung noch einmal zusatzlich. Vor diesem Hintergrund sind die Resultate des letzten Teils dieser Arbeit als wichtige methodische Fortschritte in der Spharoid-Technologie zu werten. Hier wurde gezeigt, dass die Kultivierung von dissoziierten Retinazellen eine geeignete Technik ist, um die Bildung von Rosettenspharoiden mit den fur sie charakteristischen histotypischen Strukturen herbeizufuhren. Somit ist von nun an eine Methode verfugbar, die eine kontinuierliche mikroskopische Betrachtung des Reaggregationsprozesses und der sich anschliesenden Entwicklung von histotypischen Strukturen moglich macht. Auch die hier ebenfalls vorgestellte Variante, bei der vorher in Rotationskultur gebildete Spharoide ausplattiert werden, ist dafur geeignet. Die Kombination aller in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse eroffnet den Ausblick auf vielfaltige Moglichkeiten fur die Nutzung von Spharoidkulturen in der Zukunft. Zu den ver-besserten Methoden zur Auswertung der Einflusse von Wachstumsfaktoren und anderen biologisch wirksamen Substanzen auf die Retinogenese in vitro, kommt nun zusatzlich ein verbessertes Verstandnis der Bildungen von IPL-Bereichen in Spharoiden hinzu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch bFGF innerhalb von 24 Stunden Aktivitaten in einer regional begrenzten Zellpopulation eines bestimmten Zelltyps induziert werden, wo-durch die laminare Strukturierung der Spharoide deutlich gefordert wird. Durch die Kombination dieser Ergebnisse mit denen aus den hangenden Tropfen, ruckt die mikroskopische real-time-Analyse der Bildung und Strukturierung von IPL-Bereichen in vitro in greifbare Nahe. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse sollten sich nicht nur fur das Verstandnis der Entwicklung ebendieser Struktur in vivo, sondern auch fur die Zuchtung von Retinagewebe in vitro als hilfreich erweisen.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/1333/7/Einleitung_+_Material_&_Methoden_2.pdf
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article