Développement de complexes polyélectrolytes à base d’acide hyaluronique et de chitosane pour la livraison d’ARN messager

Content Provider	Semantic Scholar
Author	Soliman, Ousamah Younoss
Copyright Year	2018
Abstract	Parmi les differents types de nanoparticules developpes pour la livraison d'acides nucleiques, les complexes de polyelectrolytes (PEC), sont populaires en raison de leur facilite de production. Le chitosane (CS) est l'un des polycations les plus etudies pour la livraison de materiel genetique therapeutique du a ses proprietes benefiques reconnues (biocompatibilite, biodegradabilite, absence de toxicite). Lorsqu'il est melange avec l'acide nucleique, il y a une formation spontanee de PEC via un processus principalement entraine par de fortes attractions electrostatiques et un gain d'entropie associe a la liberation de contre-ions. L'ajout d'acide hyaluronique (HA) aux nanoparticules CS/ARNm est une approche prometteuse pour la livraison d'ARNm, en raison du potentiel de combiner la capacite tampon du chitosane (effet eponge protonique) avec l'hemocompatibilite amelioree fournie par l'HA negativement chargee et l'internalisation mediee par recepteur de l'acide hyaluronique, ce qui pourrait conduire a l'administration ciblee de nombreuses tumeurs qui regulent positivement l'expression des recepteurs HA tels que CD44 et RHAMM. Contrairement a d'autres glycosaminoglycanes (GAG), l'HA n'est pas sulfate et a une densite de charge relativement faible (une charge negative par dimere). En utilisant des HA sulfates, la stabilite des nanoparticules est susceptible de s'ameliorer en raison de sa densite de charge plus elevee qui lui confere une affinite de liaison plus elevee avec le chitosane charge positivement. Pour cette raison, des nanoparticules HA-CS / ARNm avec des HA sulfates et non sulfates ont ete preparees pour evaluer l'influence de la densite de charge de HA sur l'expression genique in vitro. L'objectif de cette etude etait de determiner les formulations optimales de nanoparticules CS/ARNm recouvertes de HA pour la livraison de genes en etudiant l'effet des differents parametres de formulation sur la bioactivite in vitro. Le projet a ete concu pour evaluer systematiquement l'influence des proprietes structurelles du CS et HA (poids moleculaires et densites de charge du chitosane et de l'acide hyaluronique) et la stoechiometrie des composants sur les proprietes physicochimiques des nanoparticules (NP) et l'efficacite de la transfection in vitro. Les differentes formulations de nanoparticules produites ont ete caracterisees par leur taille et leur charge de surface en utilisant la diffusion de lumiere dynamique (DLS). Ensuite ces nanoparticules ont ete transfectees in vitro dans des cellules humaines du cancer du poumon exprimant la proteine EGFP (EGFP+ H1299) afin de normaliser le signal gene rapporteur (luciferase) avec la fluorescence EGFP et avoir ainsi des signaux relatifs a la densite cellulaire dans les puits. Les resultats ont demontre que les proprietes structurelles des polyelectrolytes (masse molaire, densite de charge) ainsi que le ratio molaire des charges positives et negatives durant le melange ont un impact sur la bioactivite in vitro. La formulation optimale pour la livraison chez les cellules EGFP+ H1299 a ete determinee. Il s'agit de nanoparticules ternaires qui ont ete formees avec une charge de surface positive (exces de chitosane) en utilisant de l'acide hyaluronique de 10 kDa ayant 1.4 groupes sulfates par dimere en combinaison avec un chitosane ayant une densite de charge elevee et une masse molaire faible ou l'inverse (c.a.d. DDA=80% avec Mn=10kDa, ou DDA=92-98% avec Mn=5kDa). Ces formulations presentent un equilibre adequat entre l'avidite du systeme et la facilite de liberation de l'ARNm, resultant en un niveau d'expression ameliore. La presence du HA sulfate dans les nanoparticules resulte en une augmentation de la capacite d'internalisation cellulaire de ces systemes de livraison de genes. De plus, il a ete observe que la presence de trehalose dans ces PEC permet aussi d'augmenter l'expression genique in vitro. Le mecanisme implique dans cette derniere observation demeure inconnu. Des etudes subsequentes sont necessaires pour chercher a comprendre le mecanisme qui fait en sorte que le trehalose ameliore la bioactivite in vitro et de verifier si ce phenomene est observe in vivo.----------ABSTRACT Among the different types of nanoparticles developed for gene delivery, polyelectrolyte complexes (PEC), or polyplexes, are a popular approach due to the ease of their production. Chitosan (CS) is one of the most studied biopolymers for the delivery of therapeutic compounds due to its a recognized beneficial properties (biocompatibility, biodegradability, lack of toxicity). When mixed with nucleic acid, there is a spontaneous formation of PEC via a process mainly driven by strong electrostatic attractions and an entropy gain associated with the release of counter-ions. Adding hyaluronic acid (HA) to CS/mRNA nanoparticles is a promising approach for mRNA delivery, due to the potential to combine the buffering capacity of chitosan (proton sponge effect) with improved hemocompatibility provided by the negatively charged HA, and receptor-mediated internalization of hyaluronic acid, which might lead to targeted delivery to numerous tumors that upregulate the expression of HA-receptors such as CD44 and RHAMM. Unlike other glycosaminoglycans (GAG), HA is not sulfated and has a relatively low charge density (one negative charge per dimer). By using sulfated HA polymers, nanoparticle stability is likely to improve due to the higher charge density of sulfated HA, which would lead to a higher binding affinity with the positively charged chitosan and an increased propensity for mRNA liberation in the cytoplasm, which is necessary for gene expression. For this reason, it was decided to prepare HA-CS/mRNA particles with sulfated as well as non-sulfated HAs to assess the influence of HA charge density on in vitro bioactivity. The goal of the project is to perform a screening of HA coated CS/mRNA nanoparticles designed for mRNA delivery to study the effect of different formulation parameters on in vitro bioactivity. The project was designed to systematically evaluate the influence of CS and HA macromolecular properties (molecular weights and charge densities of chitosan and hyaluronic acid), and components stoichiometry on the physicochemical properties of the nanoparticles and their in vitro transfection efficiency. The different formulations produced have been characterized for their size and surface charge using dynamic light scattering (DLS). Then these nanoparticles were transfected in vitro in human lung cancer cells expressing EGFP (EGFP+ H1299). Results suggest that the molecular properties of polyelectrolytes (molar mass, charge density) as well as the molar ratio of positive and negative charges during mixing have an impact on in vitro bioactivity. The optimal formulation for delivery in EGFP+ H1299 cells was determined. These are HA-CS/mRNA nanoparticles that have been formed with a net positive charge (thus with an excess of chitosan) using chitosan having a degree of deacetylation greater than 80% and a molecular weight of less than or equal to 10 kDa, and using sulfated hyaluronic acid with 1.4 sulfate groups per dimer and a molar mass of 10 kDa. It appears that this formulation results in polyelectrolyte complexes that are stable enough to protect the mRNA from nucleases and deliver it to the cells, while allowing for release of the mRNA into the cytoplasm. The presence of sulfated HA has demonstrated increased cell internalization capacity. In addition, it has been observed that the presence of trehalose in polyelectrolyte complexes increases gene expression in vitro. The mechanism involved in this observation remains obscure. Subsequent studies are needed to understand the mechanism by which trehalose improves in vitro bioactivity and whether this phenomenon is observed in vivo.
File Format	PDF HTM / HTML
Alternate Webpage(s)	https://publications.polymtl.ca/3121/1/2018_OusamahYounossSoliman.pdf
Language	English
Access Restriction	Open
Content Type	Text
Resource Type	Article