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Mecanotransducción celular. Correlación entre las propiedades mecánicas y la organización-dinámica de proteínas de adhesión focal en células vivas
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Bianchi, Micaela |
| Copyright Year | 2016 |
| Abstract | Las celulas pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de senales externas, quimicas y fisicas, integrar y analizar esta informacion y, en consecuencia, cambiar su morfologia, dinamica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biologicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (celula-matriz extracelular) y uniones adherentes (celula-celula). Las adhesiones focales son complejos de proteinas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a traves de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesion son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo estan localizadas en la periferia de las celulas, y que ademas funcionarian como organelas de senalizacion en el proceso de mecanotransduccion celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas tecnicas que nos permitan analizar la dinamica intracelular, la biomecanica de la celula/sustrato, deteccion de las fuerzas generadas en/por la celula, y observar la respuesta global de la celula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecanica y dinamica de las proteinas de adhesiones focales en respuesta a un estimulo mecanico en celulas vivas requiere de tecnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinamica de eventos localizados en la celula. Estos metodos deben contar con una resolucion espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopias y espectroscopias de alta resolucion espacial y temporal, en combinacion con tecnicas de biologia molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecanicas de sustratos y celulas, en una primera etapa se implemento un modo de operacion avanzado en microscopia de fuerza atomica (AFM), denominado PF-QNM (del ingles, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultaneamente la imagen de topografia, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesion, dureza, disipacion de energia y deformacion superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecanicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), asi tambien como la linea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesion focal, la estrategia fue transfectar celulas de epitelio mamario de raton (HC11), con proteinas componentes de la adhesion (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteinas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopias y espectroscopias de fluorescencia, es posible visualizar la expresion de las proteinas, registrar su localizacion y evolucion en el tiempo y, mediante diferentes analisis, extraer informacion cuantitativa de dinamica, cinetica y organizacion de los complejos de adhesion focal. El analisis de la dinamica y difusion de los complejos de adhesion focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopia por correlacion de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusion de las proteinas mencionadas. El analisis de la correlacion cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteinas de adhesion focal (FCCS) permitio evidenciar la interaccion entre distintas proteinas adhesivas de la adhesion focal. La cinetica de disociacion de proteinas desde la adhesion focal fue evaluada mediante la recuperacion de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organizacion y dinamica de adhesiones focales en celulas vivas en respuesta a un estimulo mecanico externo global, se empleo un dispositivo de traccion equibiaxial adaptado para ser usado en simultaneo con el microscopio confocal FV1000. La tension mecanica aplicada por el dispositivo de traccion es capaz de inducir cambios en el area de las celulas vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecanico se observo un mayor reclutamiento y translocacion de la proteina zixina acompanado de una disminucion significativa de su constante de disociacion. Con el fin de correlacionar las propiedades mecanicas del sustrato y la fuerza de traccion generada por la celula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organizacion y dinamica de las proteinas en la adhesion focal, se implemento la Microscopia de Fuerzas de Traccion (TFM). Esta tecnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de traccion generada por la celula sobre un sustrato elastico y transparente, la cual se puede combinar con otras tecnicas de microscopia de fluorescencia como FRAP o FCS. El analisis de los datos TFM para la proteina zixina permitio obtener los mapas de deformacion y de fuerzas de traccion, a la vez que se evaluo la cinetica de disociacion mediante FRAP. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_5945_Bianchi.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
