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Na + -translozierende rotatorische Membranproteinkomplexe aus dem anaeroben Bakterium Acetobacterium woodii: Vergleichende molekulare und biochemische Analyse des Flagellums und der F1FO-ATPase
| Content Provider | Semantic Scholar |
|---|---|
| Author | Aufurth, S. |
| Copyright Year | 2001 |
| Abstract | 1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und funf vollstandige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils uber eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfugten und groser als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche lies sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwarts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die fur die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ahnlichkeit keinem bekannten Protein ahnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, das orfA fur ein Protein kodiert. Stromabwarts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ahnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosauresequenz grose Ahnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Spharoplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkorper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Praparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkorper-Komplexe der Na + -abhangigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, das diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhangigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Grose den Mot-Komplexen der H + -abhangigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den funf Antiseren liesen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und e identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhangig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhohte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration uber Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besas alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivitat der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa. |
| File Format | PDF HTM / HTML |
| Alternate Webpage(s) | https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15/1/Aufurth_Sascha.pdf |
| Language | English |
| Access Restriction | Open |
| Content Type | Text |
| Resource Type | Article |
